埃博霉素生物合成.ppt

1、埃博霉素 （Epothilones）,埃博霉素（ Epothilones ）是一種天然產(chǎn)物，1993年由德國生物技術(shù)研究公司的科學家Hofle從降解纖維素的粘液菌，纖維堆囊菌的培養(yǎng)液中分離得到，最開始作為抗真菌藥和殺蟲劑研究，但對植物的毒性太大。 1995年，美國Merck公司的科學家也獨立地分離得到了埃博霉素，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)這些化合物能夠殺死腫瘤細胞，其作用機理與紫杉醇的機理相似，能夠促進微管蛋白的聚合，形成穩(wěn)定的細胞微管，抑制癌細胞的分裂，從而導致癌細胞死亡，后來這一重大發(fā)現(xiàn)也被Hofle等證實。,Epothilones,Epothilones,紫杉醇在治療卵巢癌、肺癌、頭頸部癌癥和其他癌

2、癥均表現(xiàn)出不凡的療效，市場總銷售額已超過200億。但是，紫杉醇生物利用度差、副作用嚴重，尋找具有微管穩(wěn)定功能又不具這些缺點的“后紫杉醇藥物”成為研究熱點。在多種藥物的篩選中埃博霉素抗癌活性最理想。,埃博霉素對許多藥物治療效果不穩(wěn)定的癌細胞以及多藥配伍易產(chǎn)生抗藥性的癌細胞也具有高活性，表現(xiàn)出對紫杉醇及其它抗癌藥物有耐藥性的癌細胞具有優(yōu)異的療效；一些全合成的埃博霉素同系物不僅能夠抑制惡性腫瘤的增長，而且能使其萎縮，甚至消失，并維持很長的時間不再復發(fā)，這種優(yōu)異的抗癌活性在抗癌藥物中是極其少見的。 水溶性比紫杉醇更好，便于配制和使用；此外，埃博霉素不僅可以通過發(fā)酵的方法大量制備，由于結(jié)構(gòu)相對簡單，也容

3、易通過全合成得到，以及進行化學修飾，得到其它衍生物，這對于進一步的藥物篩選非常用。 紫杉醇現(xiàn)有資源破壞嚴重，后續(xù)資源不足，埃博霉素可能是更為理想的替代。,Enter your title here,結(jié)構(gòu),埃博霉素是一類16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯化合物，在15位置連接了一個含噻唑環(huán)的側(cè)鏈。 由發(fā)酵制備時，埃博霉素和是主要產(chǎn)物，埃博霉素是次要產(chǎn)物，但可以經(jīng)一步反應從或者得到。 埃博霉素、和對癌細胞的生物活性與紫杉醇相當，甚至更強，尤其是埃博霉素，其活性比紫杉醇強10-100倍在12位上的有甲基取代，以及12-13雙鍵換成環(huán)氧基團后，埃博霉素的活性將極大提高。,A: R=H B: R=Me,C: R=H D

4、: R=Me,E: R=H F: R=Me,埃博霉素作為極其有潛力的抗癌新藥，引起了全世界的化學家、生物學家及藥學家的極大興趣和研究熱情。從1993年發(fā)現(xiàn)至今十多年時間，有關(guān)埃博霉素的研究報告達500多篇，天然的埃博霉素和已經(jīng)進入了臨床期試驗，化學合成的埃博霉索內(nèi)酰胺已經(jīng)進入了臨床期試驗。,Enter your title here,如果說紫杉醇從發(fā)現(xiàn)到成為藥品上市經(jīng)過了二十多年的時間，埃博霉索成為臨床用藥可能只需要十多年的時間。,發(fā)酵是大規(guī)模生產(chǎn)的理想途徑，不似有機合成的繁瑣，并有望提高產(chǎn)量，也能改變埃博霉素累化合物的種類，產(chǎn)生多種埃博霉素類似物。篩選更廣泛的埃博霉素產(chǎn)生菌是一條有效的途徑，

5、埃博霉素發(fā)酵的提升潛能還很大。但高產(chǎn)菌株難獲得，生產(chǎn)周期長?，F(xiàn)有的生物合成體系用于大規(guī)模生產(chǎn)仍有一定局限性。,全合成 生物合成,埃博霉素結(jié)構(gòu)較紫杉醇簡單化學合成備受關(guān)注。埃博霉素一問世，就相繼報道了數(shù)十條全合成路線。目前全 合成的方法不下30種，但具有商業(yè)價值的全合成方法必 須具備合成步驟短、雜質(zhì)片段少、總產(chǎn)率高這個優(yōu)勢。目前全合成埃博霉素步驟冗長，產(chǎn)率低，全合成生產(chǎn)仍在逐步完善。,合成,埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的半合成,埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物埃博霉素D埃博霉素B埃博霉素A紫杉醉,（亞硝基胍）誘變 選育埃博霉素高產(chǎn)菌株,發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B,化學結(jié)構(gòu)修飾,埃博霉素B內(nèi)酰胺,美國施貴寶公司的埃博霉素

6、B內(nèi)酰胺衍生物（“依沙匹隆”）規(guī)格45mg/支批發(fā)價為2765.89美元,Enter your title here,菌種誘變,取纖維堆囊菌于5mL G52培養(yǎng)基培養(yǎng)48，離心收集菌體，用pH6.0的磷酸緩沖液洗滌兩次，然后重懸于mLpH6.0的磷酸緩沖液中，制成菌懸液。 取NTG母液，加入菌懸液中，配制成各濃度的含NTG的菌懸液，在不同溫度下進行誘變處理30min。將菌懸液4離心，用冷無菌水洗滌次以終止誘變。 加入相同體積的52液體培養(yǎng)基，30，180rpm培養(yǎng)1.5h，渡過生理延時期。將誘變后的菌液用無菌生理鹽水十倍稀釋，涂于VY/2平板，30，培養(yǎng)-。,G52培養(yǎng)基 ：酵母粉2gL，Mg

7、SO47HO1gL，CaCl2HO1gL，脫脂奶粉 2gL，馬鈴薯淀粉8g/L，無水葡萄糖2gL，EDTA鐵鈉 8mg/L，KOH 調(diào) pH 至 7.4 VY/2 固體培養(yǎng)基 ：酵母提取物5g/L,CaCl22H2O1gL，VB120.5mgL，Agar15L，KOH調(diào)pH至7.2,Enter your title here,正突變菌初篩,取直徑1-2mm的單菌落接種于G52液體培養(yǎng)基，30、180rpm振蕩培養(yǎng)d，接入1B12發(fā)酵培養(yǎng)基。6后，于培養(yǎng)平板上放置牛津杯，在杯中加發(fā)酵液。每個平板上都有一個原種的發(fā)酵液作為對比，平板上涂有古巴號AS2.1189.5釀酒酵母。,正突變菌復篩,2-3后

8、挑選有藍色抑菌圈且抑菌圈大于原種的菌落，于G52液體培養(yǎng)后，再接于1B12培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，最后取發(fā)酵液16000rpm，min離心后取上清液通過高效液相色譜檢測產(chǎn)物峰。 色譜條件：色譜柱：AgilentXDB-18，2004.6；柱溫：30；檢測：250nm，UV-DAD；流動相：磷酸-乙腈溶液。,Enter your title here,分析選取高產(chǎn)菌株,將標準品EpothilonesB 溶于色譜純的甲醇溶液，配制成一系列濃度，分別為：5ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、50ug/mL。使用HPLC檢測標準樣，進樣量為20uL，每個濃度進樣三次以保證數(shù)據(jù)的正確性。同時使用色譜純

9、甲醇進行空白對照。 埃博霉素的出鋒時間在16min左右，將各個濃度所得的數(shù)據(jù)匯總，以濃度為橫座標，鋒面積為縱坐標繪制標準曲線。,比較復篩菌液上清的出峰時間是否與標準品一致，已確定結(jié)果是否可信。利用樣品峰面積和標準曲線方程求算產(chǎn)物濃度，并與原種比較，選取最優(yōu)菌株。,Enter your title here,發(fā)酵,取選出的高產(chǎn)菌株接種于500mL 1B12培養(yǎng)基，加入吸附樹脂（XAD-16），發(fā)酵培養(yǎng)6d。將發(fā)酵液過濾得樹脂，純水洗滌2次，加10ml甲醇洗脫。減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯抽提，減壓蒸干。,Enter your title here,化學修飾,埃博霉素B（98g，199.4mmol） 疊氮鈉（15.54g，24mmol） 懸浮于THF-H2O（5：1）2L，氮脫氣20min，加三苯基膦鈀在氬氣環(huán)境下45催化