臨床微生物檢驗與臨床.ppt

1、臨床微生物檢驗與臨床,臨床微生物科 李 浩,微生物檢驗的重要性,在醫(yī)學(xué)高度發(fā)展，新的抗菌藥物不斷涌現(xiàn)的今天，感染性疾病的發(fā)病率和病死率仍然居高不下。主要原因之一是當(dāng)代的感染性疾病，在病原上發(fā)生了較大的變化，形成了現(xiàn)代感染性疾病在病原學(xué)上的新特點,現(xiàn)代感染性疾病的新特點,以條件致病菌為主：很多低致病、弱毒的細(xì)菌，在外環(huán)境、人體體表以及與外界相通的腔道中廣泛存在的細(xì)菌，引起感染甚至造成嚴(yán)重后果的現(xiàn)象日益增多。 病原菌的種類更為廣泛：包括需氧菌、厭氧菌、苛氧菌、分枝桿菌和真菌等。,細(xì)菌的耐藥性不斷增強：同一種細(xì)菌對抗生素的耐藥性可以完全不同，甚至出現(xiàn)同時耐多種抗生素的“多重耐藥”細(xì)菌，往往使臨床醫(yī)師

2、的“經(jīng)驗性”治療或所謂的常規(guī)治療根本無效。,現(xiàn)代感染性疾病的新特點,提高感染樣本送檢率 加強細(xì)菌耐藥監(jiān)測 關(guān)注細(xì)菌性疾病的病原學(xué)診斷，已成為臨床工作者、臨床微生物與微生態(tài)工作者、藥學(xué)家和從事感染控制的工作者共同關(guān)注的熱門焦點。,病原微生物送檢是感染控制的基礎(chǔ),成功治療感染癥的因素 成功分離病原菌 標(biāo)本收集、運送、保存 標(biāo)本處理方法 檢驗醫(yī)師專業(yè)知識 醫(yī)師判讀病原菌培養(yǎng)結(jié)果 選擇適當(dāng)治療方法,臨床醫(yī)生要合理用好兩種數(shù)據(jù),1. 本地區(qū)、本單位病原流行病學(xué)資料，指導(dǎo)經(jīng)驗用藥。（微生物室、院感科、臨床科室） 2.藥敏試驗報告，糾正經(jīng)驗用藥。 重視病原學(xué)檢查,盡可能在應(yīng)用抗菌藥物之前留取標(biāo)本送檢。以提高

3、病原學(xué)診斷率,為選藥和調(diào)整藥物提供依據(jù)。,“正確的微生物學(xué)檢驗始自正確的標(biāo)本采取。臨床醫(yī)師、護(hù)師及檢驗技師都必須通曉其要領(lǐng)?！?著名的臨床微生物檢驗專著Manual of Clinical Microbiology 的主編Patrick Murray,標(biāo)本采集和運送是細(xì)菌培養(yǎng)成功的最最重要的關(guān)鍵 但由于標(biāo)本的采集和運送常由護(hù)士或醫(yī)生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道問題所在之處，造成的后果是: 臨床醫(yī)生最不能接受的問題:陽性率低,國內(nèi)微生物標(biāo)本的采集目前存在的問題 ： 標(biāo)本送檢率低 從全國來看，抗感染治療前，送檢相關(guān)標(biāo)本可能只占應(yīng)送標(biāo)本的一半左右，與抗菌藥物應(yīng)用率之高形成鮮

4、明的反差。一些醫(yī)師在經(jīng)驗性治療受挫后方送標(biāo)本，此時已失去陽性培養(yǎng)的機會。 標(biāo)本有缺陷 正確收集各種臨床標(biāo)本，關(guān)注特檢標(biāo)本采樣與送檢的方法和條件，是完成病原學(xué)診斷的先決條件。,微生物讓人類步步為營， 我們應(yīng)該追求： “準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷” “針對性病原學(xué)治療” 正確的微生物標(biāo)本采集和運送，是準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷的前提！,基本原則,1.及時采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查 2.在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本 3.采樣時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作 4.采樣后立即送檢 5.標(biāo)本容器須滅菌處理，但不得使用消毒劑 6.送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗?zāi)康?常見不合格標(biāo)本主要有以下問題：,標(biāo)本采集時間錯誤 容器錯誤 標(biāo)本量不足 標(biāo)本采集延誤

5、標(biāo)本未及時正確運送 以及暫存條件錯誤。 。,最有價值的細(xì)菌學(xué)檢測項目,血液培養(yǎng) 腦脊液培養(yǎng) 膽汁培養(yǎng) 胸腹水培養(yǎng) 關(guān)節(jié)液 其他無菌體液或分泌液,血培養(yǎng)標(biāo)本,采集與運送,血培養(yǎng)是進(jìn)行血流感診斷的最佳手段,目前血培養(yǎng)的問題：,采血時機不合適 采血套數(shù)不夠 采血量不足 只做需氧培養(yǎng)，不同時做厭氧培養(yǎng) 采血前或采血時正在使用抗生素治療,相似規(guī)模醫(yī)院的血培養(yǎng)數(shù), 國內(nèi)多數(shù)三甲綜合醫(yī)院210 瓶/天 復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院2050瓶/天 香港瑪麗醫(yī)院200瓶/天 臺灣大學(xué)醫(yī)院300瓶/天 我院約1015瓶/天,1370瓶/2011年7月26日 美國，亞特蘭大，埃默里大學(xué)附屬一院，1100床位,平均100 人次/

6、天 美國，亞特蘭大，埃默里大學(xué)附屬二院，900床位,實驗室類型:美國私立大醫(yī)院微生物實驗室醫(yī)院病床數(shù): 800 beds微生物標(biāo)本量: 600個標(biāo)本/天血培養(yǎng)標(biāo)本量:150 瓶/天血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)采樣:3套瓶/24小時 (1個需氧瓶+1個厭氧瓶=1套)陽性結(jié)果:10-30株需氧或兼性厭氧菌/天, 2株厭氧菌/月BacT/ALERT 3D 240 7臺,“只有在發(fā)熱時，才需要進(jìn)行血培養(yǎng)?！?關(guān)于血培養(yǎng)指征,想采就采,？,答 案：血培養(yǎng)的指征,當(dāng)懷疑血流感染或膿毒癥時，應(yīng)常規(guī)行血培養(yǎng) 懷疑患者有血流感染的癥狀有： 不明原因的發(fā)燒(38)或體溫過低(36) 白細(xì)胞增多（ 10,000/ul），粒細(xì)胞減少（

7、 1,000ul） 休克，寒顫，僵直 嚴(yán)重的局部感染(腦膜炎，心內(nèi)膜炎，肺炎，腎盂腎炎，腹部術(shù)后感染，) 心率異常加快 低血壓或高血壓 呼吸頻率加快,“何時采血進(jìn)行血培養(yǎng)，無特殊時間要求。”,關(guān)于采血時機,？,你認(rèn)為對嗎？為了提高病人血培養(yǎng)的陽性率，最好的抽血時間是：,A.發(fā)熱開始時B.寒戰(zhàn)開始時C.發(fā)熱最高峰時D.寒戰(zhàn)結(jié)束時E.預(yù)計寒戰(zhàn)發(fā)熱前,0,30,60,時間 (分鐘),體溫,血培養(yǎng)采血時機,細(xì)菌濃度,答 案：采集血培養(yǎng)樣本的最佳時間,盡可能在患者寒戰(zhàn)或開始發(fā)熱時采血 在患者接受抗生素治療前采血 如患者已經(jīng)應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行治療，應(yīng)在下一次用藥之前采血培養(yǎng),“為減輕患者痛苦，只從一個穿刺部

8、位采一份血液標(biāo)本即可?！?關(guān)于采血套數(shù)及部位,？,基本概念,成人“一套” 血培養(yǎng)應(yīng)該包括需氧瓶和厭氧瓶各一個，也叫“一份” 注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套應(yīng)從另一個穿刺點獲得。 兒童一般只做需氧培養(yǎng)，但仍需從多個部位采集多次。特殊患者才考慮厭氧培養(yǎng)。,采血套數(shù),Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548,表皮葡萄球菌的臨床意義,23套血培養(yǎng)，有助于污染的判斷。

9、,Tokars, JI. Clin Infect Dis 2004; 39:333,污染菌,致病菌,？,采集1套無法判斷是病原菌還是污染菌。,答 案 ：關(guān)于血培養(yǎng)套數(shù)與采血部位,每位患者每次采血最少2套，3套更好 初發(fā)患者，絕不能只采1套標(biāo)本 多個穿刺部位采血。因多部位同時發(fā) 生污染的幾率較小，便于對結(jié)果進(jìn)判斷,“兩套血培養(yǎng)采集間隔無特殊要求。”, 關(guān)于采血間隔,？,答案：關(guān)于標(biāo)本采集間隔時間,對于非持續(xù)性菌血癥，同時或短時間內(nèi)采集23套血培養(yǎng)，因為體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)會在1530min內(nèi)清除掉進(jìn)入人體內(nèi)的細(xì)菌。 可疑急性心內(nèi)膜炎患者要立即取血作血培養(yǎng)，30分鐘內(nèi)完成3套血培養(yǎng)的采集，采集后立

10、即進(jìn)行抗菌藥的經(jīng)驗治療。如果24小時內(nèi)報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。 可疑的亞急性心內(nèi)膜炎患者每間隔30分鐘至1h采集1套，連續(xù)采集3套標(biāo)本。如果24小時內(nèi)報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。,“每瓶采集多少血液無特殊要求?！? 關(guān)于采血量,？,菌血癥病人血中細(xì)菌濃度 成年病人: 鏈球菌心內(nèi)膜炎 1 to 30 organisms/ml 葡萄球菌心內(nèi)膜炎 1 to 20 organisms/ml 革蘭氏陰性菌血癥 少于1 to 10 organisms/ml 革蘭氏陽性菌血癥 1 to 300 organisms/ml 幼兒病人: 革蘭氏陰性菌血癥 5 to 1000 organisms/ml

11、75%幼兒菌血癥病人血液有100 organisms/ml 所以采血量一定要足夠！,采血量(ml)與檢出率的關(guān)系,Overall,血培養(yǎng)物每增加一毫升，真性菌血癥 成年人微生物的檢出率增加3,但并非越多越好，超過一定數(shù)量的采血量會稀釋培養(yǎng)瓶內(nèi)的肉湯，使肉湯無法有效中和血中的抑制物質(zhì)（補體、抗體、抗生素）。所以血液與肉湯的最佳比例為1：41：10,答 案：關(guān)于采集血液量,采血量是影響靈敏度最關(guān)鍵因素 成人一份標(biāo)本2個培養(yǎng)瓶（需氧厭氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采兩份標(biāo)本，即40ml。 兒童一般只需采集需氧瓶，在保證采集血量1總血量下，一般為13ml 采血量不足時應(yīng)優(yōu)先保證需氧瓶，因臨

12、床90以上的感染為需氧菌或兼性需氧菌感染,先采生化、凝血標(biāo)本，再采血培養(yǎng)標(biāo)本?！?關(guān)于各種血液標(biāo)本的采集順序,？,血培養(yǎng)對無菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它標(biāo)本要高。 所以要最先采集血培養(yǎng)標(biāo)本。 污染率的指標(biāo)是 3% （100份標(biāo)本里只能有不到3個標(biāo)本出現(xiàn)污染。）,答案：采各種血液標(biāo)本的先后順序,“消毒的重點是足夠量的消毒劑。”,關(guān)于皮膚及培養(yǎng)瓶消毒,？,皮膚消毒程序：,推薦使用碘町、洗必泰或碘伏作為皮膚消毒劑。 碘町作用1min 碘伏作用1.5-2min 洗必泰作用時間與碘町一樣（但不能用于少于2個月嬰兒皮膚消毒）,培養(yǎng)瓶的消毒程序：,去掉培養(yǎng)瓶口的塑料瓶蓋。 75%酒精消毒血培養(yǎng)瓶

13、橡皮塞子60秒。 自然待干。 將標(biāo)本注入培養(yǎng)瓶內(nèi)。 5. 顛倒混勻標(biāo)本與肉湯，以避免血液凝集。,“培養(yǎng)瓶未使用時，需要冷藏或冷凍。”,關(guān)于培養(yǎng)瓶的儲存溫度,？,不需冷藏，更不能冷凍。保存在1525的室溫即可，溫度過低會導(dǎo)致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。,答案：關(guān)于未用培養(yǎng)瓶的儲存溫度,“加入標(biāo)本后的培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，可以冷藏或放入35的溫箱?！?關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢,？,培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，存在室溫即可，不能冷藏也不能放入35 的溫箱 。過夜不會對檢測造成影響，但仍需盡快送檢。冷藏可能導(dǎo)致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。溫箱會導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入生長對數(shù)期，從而錯過檢測的最佳時期。,答

14、案：關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢,“患者靜脈中插有導(dǎo)管，可直接從導(dǎo)管采血。”,關(guān)于采血部位,？,不可以，常規(guī)血培養(yǎng)不宜從靜脈導(dǎo)管或靜脈留置裝置中采集，檢出污染或定植菌的可能性較大。除非懷疑導(dǎo)管相關(guān)性血流感染，請參照導(dǎo)管相關(guān)性血流感染的采血方法。,答案：關(guān)于從靜脈留置裝置直接采血,有臨床意義的分離株Bourbeau PP et al. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol. 2005; 43:2

15、506-2509,結(jié)果表明培養(yǎng)的前三天，有臨床意義分離株的97%被檢出，培養(yǎng)前兩天的檢出率為94%。,97,痰培養(yǎng)標(biāo)本,采集與運送,病原體種類繁多而復(fù)雜,使下呼吸道感染病原診斷成為難題,細(xì)菌（包括放線菌與奴卡菌，厭氧菌與分枝桿菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原體、衣原體與立克次體 原蟲 寄生蟲,咳痰途經(jīng)口咽部,唾液中口咽部定植菌的濃度可達(dá)108-109/ml。 研究顯示，國內(nèi)常規(guī)痰標(biāo)本中約半數(shù)存在唾液嚴(yán)重污染現(xiàn)象。,不可避免地受到污染,我國痰細(xì)菌培養(yǎng)現(xiàn)狀,標(biāo)本送檢率低 苛養(yǎng)菌檢出率極低 結(jié)果重復(fù)性差 報告速度慢 感染菌與污染菌不易區(qū)分 藥敏結(jié)果與治療反應(yīng)存在差距,咳痰標(biāo)本的采集,標(biāo)本采集方

16、法 醫(yī)師或護(hù)士直視下采集標(biāo)本 病人先漱口，去除表面的菌群 教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液 臨床上約半數(shù)咳痰標(biāo)本不合格！,關(guān)于咳痰標(biāo)本,在抗生素應(yīng)用前采集痰標(biāo)本; 標(biāo)本采集后12h內(nèi)必須立即進(jìn)行實驗室處理 咳痰標(biāo)本應(yīng)用最早且廣泛，但也是最受爭議的標(biāo)本 取標(biāo)本前應(yīng)摘去牙托，清潔口腔如刷牙和漱口 深咳，采集標(biāo)本過程中要有專業(yè)的醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo) 無痰可用35NaCl 5ml霧吸約5min導(dǎo)痰 也可用物理療法、體位引流、鼻導(dǎo)管抽吸等法取痰,幾種下呼吸道直接采集的標(biāo)本,經(jīng)氣管穿刺吸引（transtracheal aspiration,TTA） 經(jīng)胸壁針刺吸引（transthoracic needle

17、aspiration, TNA） 經(jīng)支氣管鏡采樣 支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL） 經(jīng)支氣管鏡直接吸引 防污染樣本毛刷（protective specimen brush, PSB） 開胸肺活檢（open-lung biopsy，OLB） 經(jīng)人工氣道吸引分泌物（endotracheal aspirates，ETA）,痰培養(yǎng)的送檢次數(shù),對于普通細(xì)菌性肺炎，痰標(biāo)本送檢每天1次，連續(xù)23天。不建議24h內(nèi)多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變； 懷疑分枝桿菌感染者，應(yīng)連續(xù)收集3天清晨痰液送檢；,標(biāo)本質(zhì)量,膿痰,粘液樣痰,唾液or誘導(dǎo)痰 (?),帶血痰,用革蘭氏染色

18、來評估 呼吸道標(biāo)本是否合格,呼吸道標(biāo)本的涂片評估模式,尿培養(yǎng)標(biāo)本,采集與運送,尿培養(yǎng)標(biāo)本,清潔中段尿 導(dǎo)尿?qū)Ч苣?經(jīng)恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內(nèi)尿液 送檢標(biāo)本以晨起第一次尿液為佳 不能立即送檢者，可暫存4冰箱，但保存不超過8h,清潔中段尿液,盡量取早晨第一次尿液 棄去開始流出的尿液，以沖刷尿道口的細(xì)菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿 詳細(xì)告知病人以下操作步驟 女性病人 收集標(biāo)本前用清洗液沖洗干凈，從前向后仔細(xì)擦洗尿道區(qū)域 分開陰唇，開始排尿 排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 回縮包皮并清洗龜頭 排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿,導(dǎo)尿管尿液,集尿袋內(nèi)的尿液不能用作培養(yǎng)； 導(dǎo)尿管末端

19、的尿液也不能用于培養(yǎng)，因為很難避免沒有尿道菌群污染。 留置導(dǎo)管尿液標(biāo)本常通過專門的采樣端口采集，不能把導(dǎo)尿管與尿袋拔開后收集尿液。 采樣端口用酒精消毒；必要時，可先夾住導(dǎo)尿管但不能超過30分鐘；將注射器針頭插入采樣端口，抽吸出尿液；注入無菌杯或試管中,恥骨上穿刺吸取尿液,常用于患兒、泌尿道厭氧菌感染或脊柱損傷病人等。 可避免尿道或會陰細(xì)菌的污染，但對膀胱內(nèi)少量尿液的小兒難以實施。 可用于厭氧菌檢測,出現(xiàn)如下情況時，怎樣判斷？,化膿和創(chuàng)傷標(biāo)本采集,組織或器官的化膿性感染，其病原菌的來源可分為兩類： 內(nèi)源性：感染源是炎癥局部周圍器官中的正常菌群，由于損傷等因素進(jìn)入無菌狀態(tài)的組織內(nèi)，發(fā)生感染。 外源

20、性：感染源是存在于人體外部自然界的微生物，由于外傷和直接接觸通過人體表面進(jìn)入人體，造成感染。 膿液的細(xì)菌學(xué)檢查對于確定感染的種類（結(jié)核性或非結(jié)核性等）、提供藥物敏感結(jié)果和指導(dǎo)臨床治療有重要的意義。,（一）標(biāo)本采集 1開放性感染和已潰破的化膿灶 標(biāo)本采集前先用滅菌生理鹽水拭去表面滲出物，盡可能用抽吸或?qū)⑹米由钊雮?，緊貼傷口前沿取樣，從膿腫底部或膿腫壁取樣，效果最好。慢性感染，污染嚴(yán)重，很難分離到致病菌，可取感染部位下的組織，研磨成組織勻漿接種于適宜的培養(yǎng)基。 2封閉性膿腫 局部消毒后用針及注射器抽吸膿腫壁，將所有物質(zhì)置于無菌試管內(nèi)送檢，疑為厭氧菌感染時立即作床邊接種或置于厭氧轉(zhuǎn)運裝置送檢（針頭

21、插一橡皮塞隔絕空氣）。但取樣時，可能會帶入與感染過程無關(guān)的定植細(xì)菌。 3大面積創(chuàng)傷感染：可取感染組織塊或沾有膿汁的內(nèi)層敷料送檢。,（二）注意事項 細(xì)菌對干燥敏感或只能采集少量標(biāo)本時，用棉拭子采集標(biāo)本后立即放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，或采標(biāo)本前先將棉拭子沾少許肉湯以保持標(biāo)本濕度。 對于不能立即送檢的標(biāo)本，應(yīng)放4保存，培養(yǎng)淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌的標(biāo)本除外。 盡可能在用藥前采集標(biāo)本。 采樣前病灶局部應(yīng)避免用抗菌藥物或消毒劑。 革蘭染色對標(biāo)本進(jìn)行評估。涂片中如出現(xiàn)上皮細(xì)胞提示標(biāo)本已被污染。沒有上皮細(xì)胞而有白細(xì)胞說明標(biāo)本采集正確。 有的創(chuàng)傷均可有細(xì)菌污染，但不一定發(fā)生感染，因此對分離到的細(xì)菌要根據(jù)創(chuàng)傷的情況、菌

22、量和種數(shù)，收集標(biāo)本的處理過程、機體免疫力及抗生素的使用情況等多種因素來分析判斷。,與臨床溝通中常見問題,1、我們想用的藥物在藥敏試驗中 沒有做？ 可能是天然耐藥 可能是藥物的敏感性被其他藥物所預(yù)報,與臨床溝通中常見問題,2.為什么有的菌報告很多種藥物， 有的僅報告幾種藥物？ 報告的藥物種類根據(jù)細(xì)菌種類的不同而有所不同，如銅綠假單胞菌報告的藥物較多，而腸球菌報告的藥敏較少,與臨床溝通中常見問題,3、是否能將所用的藥都做藥敏試驗? 沒有必要：通過耐藥機制和標(biāo)志性藥物可以預(yù)測其他抗菌藥物的敏感性 沒有可能：不是所用藥物都可以做藥敏試驗（需要藥物在體外穩(wěn)定，需要有操作標(biāo)準(zhǔn)和解釋標(biāo)準(zhǔn)）,與臨床溝通中常見問