細胞生物學常用研究方法

1、Southern雜交: 是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。RNAi技術: 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域?？梢岳胹iRNA或siRNA表達

2、載體快速、經(jīng)濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。Southern雜交 一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。 掃描電鏡技術：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。細胞顯微分光光度計：用來描述薄膜、

3、涂層厚度超過1微米的物件的光學性能的顯微技術。免疫熒光技術：將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光標記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。電鏡超薄切片技術：超薄切片是為電鏡觀察提供極薄的切片樣品的專門技術。用當代較好的超薄切片機，大多數(shù)生物材料，如果固定、包埋處理得合適，可以切成50-100微米的超薄切片。Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。放射自顯影技術：放射自顯影技術是利用放射性同位素的電離輻射對乳膠（含AgBr或AgCl）的感光作用

4、，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究的一種細胞化學技術。放射自顯影技術（radioautography；autoradiography）用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。核磁共振技術：可以直接研究溶液和活細胞中相對分子質(zhì)量較小(20，000 道爾頓以下)的蛋白質(zhì)、核酸以及其它分子的結構， 而不損傷細胞。DNA序列分析：在獲得一個基因序列后，需要對其進行

5、生物信息學分析，從中盡量發(fā)掘信息，從而指導進一步的實驗研究。通過染色體定位分析、內(nèi)含子外顯子分析、ORF分析、表達譜分析等，能夠闡明基因的基本信息。分子雜交技術: 具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。（一）原位雜交（in situ hybridization）。用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。蛋白質(zhì)印跡法：即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種

6、實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。GFP（綠色熒光蛋白）的應用：用于特定蛋白的標記定位外，GFP亦大量用于各種細胞器的標記如細胞骨架、質(zhì)膜、細胞核等等。Shi等人曾報道將GFP融合到大腸桿菌細胞膜表面用作標記蛋白，這一技術將有助于提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研制、構建細胞生物傳感器用作環(huán)境檢測以及探測信號轉(zhuǎn)導過程等等。負染技術: 用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，

7、分辨力可達1.5nm左右。細胞融合技術：所謂細胞融合就是指在外力(誘導劑或促融劑)作用下,兩個或兩個以上的異源(種、屬間)細胞或原生質(zhì)體相互接觸,從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象稱為細胞融合(cell fusion)或細胞雜交(cell hybridization)免疫共沉淀：用抗體將相應特定分子沉淀的同時，與該分子特異性結合的其他分子也會被帶著一起沉淀出來的技術。這種技術常用于驗證蛋白質(zhì)之間相互特異性結合。常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。免疫電鏡技術：是利用電子顯微鏡在超微結構水平上研究免疫反應的一項的新技術。用電子致密物

8、質(zhì)如鐵蛋白等標記抗體，然后讓其與含有相應抗原的生物標本反應，從電鏡觀察可見電子致密物質(zhì)的所在位置，識別抗原、抗體反應的部位。由于電子顯微鏡的分辨力很高，故可準確地顯示抗原所在部位。該技術是一種在分子水平上的抗原定位法，實際上是將細胞水平的熒光抗體技術的原理應用到分子水平上。此項技術在細胞抗原成分的定位、識別以及細胞形態(tài)和功能關系的研究上，已成為重要的方法。主要用于病毒、細菌等抗原定位、免疫性疾病的發(fā)病機理及超微結構免疫細胞化學研究等。冰凍蝕刻 freeze-etching: 亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將

9、組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。BrdU incorporation：阿糖胞苷（Ara-C）對人肺腺癌細胞株A549的凋亡誘導作用及其機制。方法AraC體外作用于t549細胞，噻唑藍還原法（MTT法）檢測AraC對A549細胞增殖的抑制作用；Hoechst33258熒光染色觀察細胞核形態(tài)學的變化；單細胞凝膠電泳技術（comet assay）測定A549細胞DNA的損傷程度；以Western blotting進一步證明A549細胞發(fā)生凋亡。結果Ara-C對A549細胞的增殖有明顯抑制作用；觀察到特異性的凋亡小體；AraC導致A549細胞發(fā)生DNA鏈斷裂，并呈明顯劑量

10、依賴性增強：Western blotting顯示caspase8，9，3都不同程度被激活，多聚ADP核糖聚合酶（PARP）被剪切降解。結論揭示了AraC明顯誘導A549細胞凋亡；細胞凋亡通路不僅通過線粒體途徑，還通過膜受體途徑，兩條通路協(xié)同作用使凋亡信號增強；提示Ara-C對A549細胞有明顯的化療作用。不可能存在絕對的核蛋白啊，因為蛋白合成是在胞漿，所以核里面再怎么多，胞漿里總會有那么一點嘛。而且很多蛋白是一直在胞漿胞核之間穿梭，特別是信號通路中的很多蛋白，始終是在胞漿與胞核之間保持一個動態(tài)的平衡，不斷地在核與漿之間循環(huán)。這種動態(tài)的平衡其實也是生物體的精妙的調(diào)控機制。 采用干細胞治療有著多種

11、優(yōu)勢：低毒性（或無毒性），即使不完全了解疾病發(fā)病的確切機理治療也可達到較好的治療效果，自體干細胞移植可避免產(chǎn)生免疫排斥反應，對傳統(tǒng)治療方法療效較差的疾病多有驚人的效果。隨著胚胎干細胞和iPS細胞的研究，更可能從患者自身細胞開始獲得全能的干細胞，進而分化為所需細胞甚至器官，完全和自身匹配沒有免疫排斥的細胞或器官移植已不再是夢，當人體器官衰老的時候，將衰老器官用自身細胞培育出的相應器官替代移植，人類將有可能延年益壽。iPS細胞是通過基因轉(zhuǎn)染技術（gene transfection）將某些轉(zhuǎn)錄因子導入動物或入的體細胞，使體細胞直接重構成為胚胎干細胞（embryonic stemcell,ESC）細胞

12、樣的多潛能細胞。配體與膜上受體結合后，網(wǎng)格蛋白聚集在膜下一側(cè)，逐漸形成50-100nm的質(zhì)膜凹陷，稱網(wǎng)格有被小窩，一種小分子GTP結合蛋白在深陷有被小窩的頸部裝備成環(huán)，dynamin蛋白水解與其結合的GTP引起頸部縊縮，最終脫離質(zhì)膜形成網(wǎng)格蛋白有被小泡。1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)選用放射性標記的CDP膽堿，用放射自顯觀察，微管用羅丹明標記的抗微管蛋白，用免疫熒光觀察，比較圖像是否有相關。2用羅丹明標記微管蛋白連續(xù)注入培養(yǎng)細胞，用熒光顯微鏡觀察。3用oligo-dT對提取的RNA進行親和層析，提取MRNA進行southern雜交。4用熒光原位雜交確定。5用早熟染色體凝集實驗，PCC。6掃描電鏡技術，概念你自己找。7用綠色熒光蛋白標記CENP-E蛋白。8用BRdu incorporation培養(yǎng)，會引起DNA突變，對其進行序列分析。9用RNA干擾技術，本質(zhì)是與mRNA結合阻止期翻譯。10，用熒光共振能量轉(zhuǎn)移或酵母雙雜交實驗。杉醇還可抑制細胞在層粘連蛋白上的粘附作用。紫杉醇可使微管蛋白和組成微管的微管蛋白二聚體