第6章 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及分離純化.ppt

1、第一篇 蛋白質(zhì)化學(xué),protein,茶學(xué)與生物系 張 劍,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,1.蛋白質(zhì)分子的大小,蛋白質(zhì)的分子量：一般在1萬100萬道爾頓(D)之間; 測定方法： 1）超速離心法 2）凝膠過濾法 3）聚丙烯酰胺凝膠電泳法 4）化學(xué)組成法測定,蛋白質(zhì)分子量測定,1）超速離心法（沉降分析法）,超速離心機(jī)： 離心速度 60 000-80 000 r/min; 基本原理： 蛋白質(zhì)分子在受到強(qiáng)大的離心力作用時，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會沉降。沉降的速度與蛋白質(zhì)分子大小、溶劑的密度和粘度有關(guān)。 沉降系數(shù)：單位離

2、心場力的沉降速度，用S表示。 1S=10-13s,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,凝膠：交聯(lián)葡聚糖，商品名稱為 Sephadex; 條件： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球體）。分子為線型或能被凝膠吸附的蛋白質(zhì)不能用此法測定。 基本原理：,蛋白質(zhì)分子量測定,2）凝膠過濾法(分子排阻層析法或分子篩層析）,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測量,SDS: 基本原理：PAGE電泳時蛋白質(zhì)的遷移率與分子的靜電荷多少以及分子的大小和形狀有關(guān)；經(jīng)過SDS和少量巰基乙醇處理所有蛋白質(zhì)帶相同的負(fù)電荷，此時蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，而與原來所帶的電

3、荷和分子形狀無關(guān)。,蛋白質(zhì)分子量測定,3）聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,？,加入SDS后蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象發(fā)生改變，形成的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的形狀為長橢圓棒，遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量。,巰基乙醇破壞二硫鍵,蛋白質(zhì)分子量測定,4）根據(jù)分子組成測定最低分子量,基本原理：測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，根據(jù)其信號換算出蛋白的最低分子量； 最低相對分子質(zhì)量= 100* 55.8/鐵的百分含量，其實(shí)真實(shí)分子量是這個組成成份的n倍。 如：肌紅蛋白含0.335%的鐵，最低M=16700用其它方法測得實(shí)際為16900； 牛血清白蛋白含Trp0.

4、58%，最低M=35200，用其它方法測得實(shí)際為69000，說明它只含2個Trp殘基。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),2.兩性解離及等電點(diǎn),蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，即能和酸作用，也能和堿作用。蛋白質(zhì)分子中可解離的基團(tuán)除肽鏈末端的-氨基和-羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側(cè)鏈基團(tuán)如-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pH條件下，這些基團(tuán)能解離為帶電基團(tuán)從而使蛋白質(zhì)帶電。,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 。,第

5、五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),3.膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)的分子量1萬-100萬之間，其分子直徑1-100nm之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體。,水化層：蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如-NH3、-SH、-CONH2等和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層（水膜）。 電層：蛋白質(zhì)顆粒表面帶有同種電荷，相互排斥，因而蛋白質(zhì)不易聚集沉淀。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),3.膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運(yùn)動、光散射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。,透析：利用蛋白質(zhì)不能透

6、過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。（鹽析）,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,透析只用于除鹽類和小分子雜質(zhì),透析只用于除鹽類和小分子雜質(zhì),（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),4.蛋白質(zhì)沉淀,1）定義：在一定理化因素影響下，蛋白質(zhì)分子可因失去電荷和脫水而失去穩(wěn)定性，并發(fā)生凝聚作用，沉淀析出，這種作用稱為蛋白質(zhì)沉淀。 2）分類： 可逆沉淀：屬非變性沉淀，條件溫和，通過改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷，Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化，用透析等方法除去 沉淀劑后可復(fù)溶（鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法）。 不可逆沉淀：屬變性沉淀，條件強(qiáng)

7、烈，破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性，也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，沉淀不能再重新溶解(加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等）。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,水化層,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,蛋白質(zhì)沉淀,3）常用方法,高濃度中性鹽,加入大量的中性鹽(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl破壞了蛋白質(zhì)的水化層，中和蛋白質(zhì)的電荷，而使蛋白聚集沉淀，這種加入鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質(zhì)分離制備。 實(shí)例： 血清中加(NH4)2SO4至50%的飽和度，球蛋白先沉淀析出，繼續(xù)加至100%飽和度，則清蛋白沉淀析出。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,蛋白質(zhì)沉淀,3）常用方法,有機(jī)溶劑沉淀法,加入水

8、溶性有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、丙酮破壞水化膜，降低介電常數(shù)增加帶電質(zhì)點(diǎn)的相互作用影響雙電層，而使蛋白聚集沉淀，用于蛋白質(zhì)分離制備。 注意事項(xiàng)： a.低溫操作; b.不能長時間接觸；c.控制好量； 實(shí)例： 食品級酶制劑的生產(chǎn)；中草藥注射液、胰島素的制備,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,蛋白質(zhì)沉淀,3）常用方法,重金屬鹽沉淀：,Hg2+、Ag+、Pb+ （與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)形成不易溶解的鹽,或改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)） 實(shí)例： 醫(yī)療上稀汞試劑消毒滅菌； 喝豆?jié){或牛奶解毒。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,蛋白質(zhì)沉淀,生物堿試劑和某些酸類沉淀法：,在pH小于等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類

9、的負(fù)離子生成不溶性沉淀。 生物堿試劑：單寧酸、苦味酸、鎢酸； 酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸。,加熱變性沉淀法：,原因是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞疏水基團(tuán)外露因而破壞了水化層。如同時處于等電點(diǎn)更容易沉淀，原因是影響蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)。如做豆腐。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,5.變性與復(fù)性,蛋白質(zhì)受到某些理化因素的影響，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能隨之改變或喪失，但未導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變，這種現(xiàn)象叫變性作用。,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,次級鍵被破壞 天然結(jié)構(gòu)解體 一級結(jié)構(gòu)沒有變化,蛋白質(zhì)變性與復(fù)性,1）化學(xué)本質(zhì),2）變性因素,物理：熱、紫外線照射、

10、高壓和表面張力。 化學(xué)：有機(jī)溶劑、脲、胍、 酸、堿、重金屬陽離子、生物堿等。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,生物活性喪失（酶）； 旋光性改變，溶解度降低，粘度增大，光吸收性增強(qiáng)，擴(kuò)散系數(shù)變??； 基團(tuán)位置改變，疏水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，對蛋白酶敏感性增大。,蛋白質(zhì)變性與復(fù)性,3）表征,4）應(yīng)用,有利：變性滅菌、消毒；變性制食品；臨床分析 不利：衰老、皮膚變粗糙、干燥，。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,5.變性與復(fù)性,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性

11、，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性（renaturation）。 大多蛋白質(zhì)變性后，很難復(fù)性。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,核糖核酸酶變性與復(fù)性作用,Native ribonuclease,Denative reduced ribonuclease,Native ribonuclease,變性,復(fù)性,5.變性與復(fù)性,（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),分類：可逆變性與不可逆變性 沉淀與變性的關(guān)系： 變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性（如可逆沉淀）。 不能復(fù)性的變性即不可逆變性一定產(chǎn)生沉淀，不可逆的沉淀一定變性。 制備活性蛋白質(zhì)時要嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,6.蛋白質(zhì)

12、的顏色反應(yīng),（一）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),1）雙縮脲反應(yīng),第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。,雙縮脲在稀堿性溶液中能與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)。,通?？捎么朔磻?yīng)來定性鑒定蛋白質(zhì)； 根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的在540nm處顏色深淺，進(jìn)行蛋白質(zhì)水解程度的測定及蛋白質(zhì)的定量。,2）黃色反應(yīng)（定性鑒定）,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,蛋白質(zhì)加濃硝酸白色沉淀變黃色加堿變橙黃色。因?yàn)榈鞍字蟹枷阕灏被幔═ry、Phe、Trp），苯基與濃硝酸起硝化作用，產(chǎn)生黃色的硝基取代物，遇堿又形成黃色的鹽（硝

13、基苯衍生物）。 皮膚遇硝酸變黃,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),3）米倫反應(yīng),第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,含有酪氨酸的蛋白質(zhì)，加入米倫試劑（HgNO3，HgNO2，HNO3，HNO2的混合液）反應(yīng)，先產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成專紅色。,4）乙醛酸反應(yīng),含有色氨酸的蛋白質(zhì)，與乙醛酸混合后，沿壁慢慢加入濃硫酸，兩液層之間出現(xiàn)紫色環(huán)。,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),5）酚試劑（Folin-酚試劑）反應(yīng),第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,含酪氨酸蛋白能將Folin-酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物，（即鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）其在540 nm 有最大光吸收。,6）乙醛酸反應(yīng),蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)（G-2

14、50）染液反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色絡(luò)合物，在595 nm有最大光吸收。,蛋白質(zhì)含量測定方法： 凱氏定氮法 紫外吸收法 雙縮脲法 Folin-酚法 考馬斯亮藍(lán)法,純化的實(shí)質(zhì)：增加制品的純度或比活性。 一般程序： （1）前處理（即提?。?（2）粗分級分離 （3）細(xì)分級分離 （4）濃縮與保存。,（二）蛋白質(zhì)的分離純化,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分沉淀, 分離純化蛋白質(zhì)的主要方法：,根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離沉淀技術(shù)； 根據(jù)電荷差異分離電泳技術(shù)； 根據(jù)分子大小分離分子篩層析及透析； 利用生物分子專一性結(jié)合的特性親和層析； 選擇性吸附分離吸附層析； 根據(jù)疏水性的差異。,（二）蛋白質(zhì)的

15、分離純化,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,透析 超濾,（二）蛋白質(zhì)的分離純化,沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關(guān)。,密度梯度離心,又叫分子篩層析，分子排阻層析 分子篩是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。 具備條件：1.惰性，2.水不溶性，3.能高度水化。 常用分子篩： 葡聚糖凝膠（Sephadex） 分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽 型號：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA） 孔徑大，用于分離大分子物質(zhì) 聚丙烯酰胺凝膠,凝膠層析,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

16、與分離純化,原理： 1. 分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,凝膠層析,2.小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。,陽離子交換樹脂：強(qiáng)酸型和弱酸型(含-COOH)。處理成H+或Na+型，與陽離子交換。通常用陽離子交換樹脂來分離氨基酸。 陰離子交換樹脂：強(qiáng)堿型和弱堿型。上面結(jié)合的是陰離子，如Cl-和HO-，與陰離子交換。 層析裝置及基本步驟：裝柱，上樣，洗脫，收集。洗脫劑(一定離子強(qiáng)度和PH的鹽溶液);,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,離子交換層析,1.定義：利用蛋

17、白質(zhì)分子對其配體分子（或配基）特有的識別能力，也即生物學(xué)親合力，建立起來的一種有效的純化方法。 2.配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體，凝集素。配基先結(jié)合到瓊脂糖等介質(zhì)上作為固定相。 3.原理：先用不含配基的洗脫劑進(jìn)行洗脫，將被分離蛋白質(zhì)以外的雜志洗出來；然后用含配基的洗脫劑進(jìn)行洗脫，將被分離的蛋白質(zhì)洗出來。 4.常用方法： 免疫親和層析、金屬螯和層析、染料配體層析,親和層析,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,1.定義：蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱

18、為電泳(elctrophoresis) 。 2.幾種重要的蛋白質(zhì)電泳： SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于Pr分子量的測定。 等電聚焦電泳，通過Pr等電點(diǎn)的差異而分離Pr 雙向凝膠電泳，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。,電泳技術(shù),第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化,單 體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺 增速劑：TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺) 引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素,？,加入SDS后蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象發(fā)生改變，形成的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的形狀為長橢圓棒，遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量。,巰基乙醇破壞二硫鍵,等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）,1.定義及原理：電泳的支持物預(yù)先制成pH梯度(蔗糖作介質(zhì)），蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行電泳時，各種蛋白質(zhì)將聚焦于其等電點(diǎn)的pH梯度處，從而形成一明顯區(qū)帶。PI只有0.02