尿酸氧化酶Urate

1、背 景尿酸氧化酶(Urate Oxidase, EC1.7.3.3)，又稱尿酸酶（Uricase）是生物體內(nèi)嘌呤降解代謝途徑中的一種酶，大部分生物在嘌呤的代謝過程中產(chǎn)生尿酸，而尿酸酶能催化尿酸氧化為尿囊素。許多物種中均發(fā)現(xiàn)有尿酸酶存在，但在鳥類，爬行類動物以及高等哺乳動物(靈長類包括人類)等生物的進(jìn)化過程中，尿酸酶基因發(fā)生突變，使得在這些生物體內(nèi)，嘌呤不能被氧化為尿囊素，而是以尿酸為終產(chǎn)物。尿酸及其鹽類在水中溶解度很低,血液中過多積累會導(dǎo)致痛風(fēng)綜合癥。痛風(fēng)（gout）是一組嘌呤代謝紊亂所致的疾病，其臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥（hyperuricemia）及由此而引起的痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石

2、沉積、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形，常累及腎臟引起慢性間質(zhì)性腎炎和尿酸腎結(jié)石形成。 The pathway of purine metabolism目前臨床上治療痛風(fēng)的主要藥物是別嘌呤醇，它占領(lǐng)了美國95以上的治療痛風(fēng)藥物的市場。它是尿酸代謝過程中黃嘌呤氧化酶的抑制劑，與嘌呤代謝物競爭性抑制黃嘌呤氧化酶，使次黃嘌呤及黃嘌呤不能轉(zhuǎn)化為尿酸，從而減少尿酸的生成。但該藥的副作用也很明顯，個(gè)別病人可有發(fā)熱、過敏性皮疹、腹痛、腹瀉、白細(xì)胞及血小板減少，甚而肝功能損害等副作用。尿酸酶可以氧化尿酸為可溶性的尿囊素，在基因工程技術(shù)發(fā)展以前，從微生物中提取尿酸酶可用于臨床診斷和治療，例如產(chǎn)朊假絲酵母。但微生物產(chǎn)

3、酶量較低,限制了其廣泛應(yīng)用。通過DNA重組技術(shù)高效表達(dá)酶基因是一條提高產(chǎn)酶量的途徑。迄今為止,已有多個(gè)物種的尿酸酶基因被克隆。 但是，尿酸酶仍具有蛋白質(zhì)類藥物的共同缺點(diǎn)，如在胃腸道內(nèi)極易被蛋白酶水解；血漿半衰期較短，需反復(fù)多次注射；并且由于大分子化合物具有免疫原性，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，同時(shí)還會因局部產(chǎn)生抗體而減效等，這些缺點(diǎn)限制了尿酸酶的大范圍的、持續(xù)的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容尿酸氧化酶的純化 尿酸氧化酶的性質(zhì)研究 發(fā)酵菌液 （1）尿酸酶的動力學(xué)參數(shù)的測定 （2）尿酸酶的酸堿穩(wěn)定性測定 超聲破碎 （3）溫度對尿酸酶穩(wěn)定性的影響 鹽 析 DEAE離子交換SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)一 尿酸氧化酶粗酶提取一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

4、 學(xué)習(xí)可溶性表達(dá)蛋白質(zhì)的初步分離純化二 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式，一種是在強(qiáng)啟動子條件下的高效表達(dá)，由于蛋白的過度表達(dá)，使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無規(guī)則卷曲，以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中，這就是所說的包涵體。另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá)，即可以發(fā)生正常折疊，具有生物活性。一般情況下，細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開。用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。鹽析一般是指溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)

5、分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。三實(shí)驗(yàn)用品1器材：超聲破碎儀，離心機(jī) 2 試劑：超聲緩沖液：0.1 mol/L，pH 8.5 Tris-Gly（6.057g Tris，8.0449gGly，定容至500ml，定容前調(diào)pH至8.5。）四實(shí)驗(yàn)方法發(fā)酵菌液4000 rpm25 min離心，收集濕菌體，每1 g菌體加入15 ml超聲緩沖液。超聲機(jī)粉碎破壁，功率300 w，工作時(shí)間

6、5 s，間隔時(shí)間5 s，共90個(gè)循環(huán)。取懸于超聲緩沖液的菌體， 10000 g10 min離心，上清加(NH4)2SO4至40%濃度，靜置1 h，12000 g15 min離心，沉淀用3 ml 0.1 mol/L的pH 8.4 Tris-Gly懸溶；上清加(NH4)2SO4至70%濃度，靜置1h，12000 g15 min離心，沉淀保留。五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.量得發(fā)酵菌液體積2.量得發(fā)酵所得濕菌體重量3.超聲破碎離心后測上清OD280，體積及留樣1ml實(shí)驗(yàn)二 尿酸氧化酶柱純化一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷，選擇離子交換樹脂進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離純化。二 實(shí)驗(yàn)原理離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或

7、纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。Sepharose是表示以瓊脂糖為基質(zhì)的膠，Sepharose Fast Flow分的，就是在Sepharose分別偶聯(lián)上二乙基氨乙基，

8、羧甲基，三甲胺基，磺丙基，作為弱陰，弱陽，強(qiáng)陰，強(qiáng)陽四種離子交換填料。三實(shí)驗(yàn)用品1.器材：填料：DEAE-Sepharose F.F.；核酸蛋白儀；紫外分光光度計(jì)；梯度混合儀；分步收集器2.試劑：透析液：20 mmol/L，pH8.5的硼酸鹽緩沖液，即2.5747 g硼砂與2.0407 g硼酸溶于3000 ml蒸餾水。平衡液：20 mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5。離子交換洗脫液：0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L硼酸鹽緩沖液；2 mol/L NaCl，20 mmol/L硼酸鹽緩沖液（pH均為8.5）。三 實(shí)驗(yàn)方法將硫酸銨純化后沉淀用20ml，pH8.5，20 mmol/L硼

9、酸鹽緩沖溶解，并透析過夜。透析后測量體積，測OD280及留樣1ml。配制20 mmol/L硼酸鹽緩沖液500 ml，分別調(diào)節(jié)其pH為8.5。采用上述溶液平衡層析柱，上樣后以00.5 mol/LNaCl，20 mmol/L 硼酸鹽溶液進(jìn)行梯度洗脫，再以2 mol/L NaCl進(jìn)行柱再生，流速2 ml/min，收集尿酸酶活力峰。四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.記錄透析后體積， OD2802.測收集的尿酸酶活力峰的紫外吸收值，并繪制尿酸酶的洗脫曲線。實(shí)驗(yàn)三 尿酸氧化酶的鑒定一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)通過SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)分子量及純度二 實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯(lián)劑N，N亞甲基雙丙烯酰胺

10、（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝

11、膠電泳（簡稱SDSPAGE）。由于SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時(shí)蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計(jì)的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDSPAGE 后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。三實(shí)驗(yàn)用品聚丙烯酰胺儲液：29 g丙稀酰胺，1 g甲叉雙丙烯酰胺溶于80 ml蒸餾水，定容至100 ml。Tris緩沖溶液(1 mmol/L，pH6.8，積層膠)：于800 ml水中溶解121.1 gTris堿，用濃HCl調(diào)pH至6.8，最后加水定容至1 L。Tris緩沖溶液(1.5 mmol

12、/L，pH8.8，分離膠)：于800ml水中溶解181.7 gTris堿，用濃HCl調(diào)pH至8.8，最后加水定容至1 L。5Tris-甘氨酸電泳緩沖液：在900 ml蒸餾水中溶解15.1 gTris和94 g甘氨酸，然后加入50 ml 10（m/v）電泳級SDS的貯存液，用去離子水補(bǔ)至1000 ml。6上樣緩沖液：7 ml 4Tris-HCl (pH6.8，0.28 mol/L)，3.0 ml甘油，1 gSDS，0.93 gDTT（或兩倍摩爾濃度的巰基乙醇），1.2 mg溴酚藍(lán)。考馬斯亮藍(lán)染色液：90 ml的甲醇:水（1:1，V/V）和10 ml冰乙酸混合液中溶解0.25 g考馬斯亮藍(lán)R250

13、，過濾。脫色液：45 ml甲醇、45 ml水和10 ml冰乙酸。四 .實(shí)驗(yàn)方法取待測樣液適量，加入6上樣緩沖液，混勻，沸水浴加熱5 min，用于上樣。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電壓80 V，電泳完畢后，剝膠，考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色至本底透明后攝片。五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)電泳結(jié)果判斷尿酸酶亞基分子質(zhì)量及純度。實(shí)驗(yàn)四 尿酸氧化酶的活力測定一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^尿酸氧化酶活力測定方法的學(xué)習(xí)，了解一類酶的活力測定方法。二 實(shí)驗(yàn)原理酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應(yīng)的速度，反應(yīng)速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來表示。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密

14、切，環(huán)境的溫度、pH、離子強(qiáng)度等都對酶的活力有很大的影響，因此測定酶活力時(shí)應(yīng)該使這些條件保持恒定。 酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）mol數(shù)表示之。測定酶活性的方法很多，常因反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同可選用不同的方法，應(yīng)用最廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應(yīng)系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測定。如果酶催化的是一需氧反應(yīng)，如氧化酶，則可用測壓法或氧電極法。如果催化的反應(yīng)系統(tǒng)中需要ATP或產(chǎn)生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶；或者反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行

15、測定。總之，測定酶活性的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的方法。三 實(shí)驗(yàn)用品底物液：0.001%尿酸（緩沖體系為0.1 mol/L，pH8.5硼酸緩沖液）四 實(shí)驗(yàn)方法酶活測定反應(yīng)體系均為0.1 mol/L，pH 8.5硼酸緩沖液，以0.001%尿酸為底物，25 反應(yīng)5 min，每隔30 s測一次293 nm處吸光值。酶活單位定義為每分鐘催化1 mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制尿酸酶各步驟純化后的活力回收表。實(shí)驗(yàn)五 尿酸氧化酶性質(zhì)研究一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶δ蛩崦傅闹饕再|(zhì)進(jìn)行研究，探討影響尿酸酶活力的各種因素及尿酸酶的最佳保存條件。二 實(shí)驗(yàn)原理酶促反應(yīng)動力學(xué)（kinetics of en

16、zyme-catalyzed reactions）： 酶反應(yīng)動力學(xué)主要研究酶催化的反應(yīng)速度以及影響反應(yīng)速度的各種因素。在探討各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，通常測定其初始速度來代表酶促反應(yīng)速度，即底物轉(zhuǎn)化量k+2時(shí)，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶與底物親和力的大小，即Km值越小，則酶與底物的親和力越大；反之，則越小。 Km可用于判斷反應(yīng)級數(shù)：當(dāng)S100Km時(shí)，=Vmax，反應(yīng)為零級反應(yīng)，即反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān)；當(dāng)0.01KmS100Km時(shí)，反應(yīng)處于零級反應(yīng)和一級反應(yīng)之間，為混合級反應(yīng)。 Km是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的Km值是恒定的，因而可以通過測定不同酶（特別

17、是一組同工酶）的Km值，來判斷是否為不同的酶。 Km可用來判斷酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種不同的底物存在時(shí)，Km值最小者，為該酶的最適底物。 Km可用來確定酶活性測定時(shí)所需的底物濃度：當(dāng)S=10Km時(shí)，=91%Vmax，為最合適的測定酶活性所需的底物濃度。 Vmax可用于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)的計(jì)算：當(dāng)酶的總濃度和最大速度已知時(shí)，可計(jì)算出酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，即單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。 Km和Vmax的測定：主要采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法和Hanes作圖法。 2酶濃度對反應(yīng)速度的影響：當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時(shí)，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即=kE。 3溫度對反應(yīng)速度的影

18、響：一般來說，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但當(dāng)溫度增加達(dá)到某一點(diǎn)后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達(dá)到一最大值時(shí)的溫度就稱為酶的最適溫度。酶的最適溫度與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，因而它不是酶的特征性常數(shù)。低溫時(shí)由于活化分子數(shù)目減少，反應(yīng)速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復(fù)。 4pH對反應(yīng)速度的影響：觀察pH對酶促反應(yīng)速度的影響，通常為一鐘形曲線，即pH過高或過低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時(shí)溶液的pH值就稱為酶的最適pH。人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pH在6.58.0之間。酶的最適pH不是酶的特征性常數(shù)。三實(shí)驗(yàn)用品乙酸、乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、尿素，次黃嘌呤，EDTA均為試劑純四實(shí)驗(yàn)方法（選做） 1. 尿酸酶的動力學(xué)參數(shù)的測定：利用尿酸為底物，直接測定其催化尿酸的性質(zhì)。測試指標(biāo)包括：Vmax，Km，Kcat。在pH8.5，0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液中配制下列各濃度底物液：0.000125%、0.00025%、0.0005%、0.001%、0.002%的尿酸溶液。于25取3 ml底物液，加10 l酶液測定反應(yīng)速度。米氏常數(shù)的測定用Lineweaver-Burk作圖法。2.尿酸酶的酸堿穩(wěn)定性測定：配制0.1 mol/L NaAc-HAc（pH3.65.2），0.1 mol/L N