動(dòng)物細(xì)胞工程-細(xì)胞工程.ppt

1、第二個(gè)動(dòng)物細(xì)胞工程學(xué)科，動(dòng)物細(xì)胞工程學(xué)科，染色體工程學(xué)科，4.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性，4.1.1體外培養(yǎng)細(xì)胞的類(lèi)型，是否附著？-嗯？1)壁形細(xì)胞：是附著在任何固相支撐物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。2)懸浮細(xì)胞：是不需要附著在固相支撐物表面，在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)的細(xì)胞。壁形，粘合：是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)的基本存在方式。根據(jù)粘附特性，使細(xì)胞和細(xì)胞徐璐結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須附著在固相表面才能生存和生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)：牙齒細(xì)胞被放置在體外環(huán)境中，然后附著在同一個(gè)固相表面才能生存和生長(zhǎng)，所以它們屬于壁狀細(xì)胞。1，成纖維細(xì)胞型：胞體呈紡錘形，中央有卵圓孔核，胞質(zhì)突出，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除了真正的纖

2、維細(xì)胞外，源于中胚層間充質(zhì)的組織(如心肌、平滑肌、骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等)通常表現(xiàn)出本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維相似時(shí)，可以稱為成纖維細(xì)胞。2.上皮型細(xì)胞：細(xì)胞是扁平的、不規(guī)則的多邊形型，中央有圓形核，細(xì)胞徐璐緊密連接，以單層膜連接。生長(zhǎng)時(shí)膜移動(dòng)，膜邊緣的細(xì)胞總是與膜相連，很少單獨(dú)移動(dòng)。源于內(nèi)外胚層的細(xì)胞，皮膚表皮及其衍生物，消化道上皮，肝胰腺，肺泡上皮等都是上皮型的。3.有股細(xì)胞型：分散在生長(zhǎng)，一般不連接，細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常突出，活躍的有股或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。牙齒細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)很難與其他細(xì)胞區(qū)分。4.多型細(xì)胞型：某些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，很難確定其規(guī)則和穩(wěn)定的形態(tài)，可以通過(guò)這種類(lèi)型。成纖維細(xì)胞樣

3、細(xì)胞，名稱：培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似的來(lái)源：中胚層間充質(zhì)組織起源的組織：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)成纖維細(xì)胞貼紙和擴(kuò)張過(guò)程，上皮型細(xì)胞，3，有股細(xì)胞型：分布在生長(zhǎng)中，一般不變成碎片。牙齒細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)很難與其他細(xì)胞區(qū)分。4.多型細(xì)胞型：某些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，很難確定其規(guī)則和穩(wěn)定的形態(tài)，可以通過(guò)這種類(lèi)型。壁狀細(xì)胞必須附著在某種固相支撐物表面才能生長(zhǎng)，附著在墻上可以表現(xiàn)出特定的形態(tài)特征。圖中顯示的細(xì)胞類(lèi)型是.A:纖維細(xì)胞型B:有股細(xì)胞型C 3360上皮細(xì)胞D:多型細(xì)胞型，(2)懸?。阂?jiàn)于某些茄子特殊細(xì)胞，如特定類(lèi)型的癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞。胞體原型沒(méi)有附著在支撐物上，懸浮增

4、長(zhǎng)。這種細(xì)胞容易大量繁殖。懸浮型細(xì)胞，4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(P39)，核型(染色體)正常貼膜依賴性，接觸抑制和密度抑制表明增殖抑制，細(xì)胞在介質(zhì)表面生長(zhǎng)到聚合單層時(shí)停止增殖。抑制接觸，細(xì)胞徐璐接觸后，培養(yǎng)正常的細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞的相互接觸可以抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，所以這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(Contact Inhibition)。細(xì)胞接觸聚合成片劑后發(fā)生接觸抑制，但如果營(yíng)養(yǎng)充足，細(xì)胞會(huì)分裂增殖，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增加。大衛(wèi)亞設(shè)，美國(guó)電視電視劇，細(xì)胞名言)但是，細(xì)胞密度更大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增加，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)枯竭和代謝物質(zhì)的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。，contac

5、t inhibition，die，produce new cells，4.1.3培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程，1個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，living cell dynamics，the neuronal center 4.1.4培養(yǎng)細(xì)胞這是粉彩小體，又名X小體，通常位于肝氣核膜邊緣。1949年，美國(guó)學(xué)者腳(M.L.Barr)等發(fā)現(xiàn)母貓的神經(jīng)細(xì)胞間隙核中，有深染的小身軀，但沒(méi)有公貓。在人類(lèi)中，男性細(xì)胞核中幾乎沒(méi)有或完全沒(méi)有噬菌體，女性有一個(gè)。之后的研究表明，噬菌體是性染色體異固體的結(jié)果。Barrbody、Barrbody、Barrbody、Barrbody-性別鑒定、Barr body失活是隨機(jī)的、4.1.5

6、體內(nèi)細(xì)胞差異和培養(yǎng)細(xì)胞分化、體內(nèi)細(xì)胞差異培養(yǎng)細(xì)胞分化、4.2細(xì)胞培養(yǎng)溶液、4.2.1，4.2.2培養(yǎng)基，基于細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求，體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基必須滿足細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、促生長(zhǎng)因子、激素、滲透壓力、pH等的要求。無(wú)毒、無(wú)污染、體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物和部分有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗力，因此培養(yǎng)基必須達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染(如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等)、對(duì)細(xì)胞有損傷的其他生物活性物質(zhì)污染(如抗體、補(bǔ)體等)。對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)自采訪過(guò)程和生物材料本身，必須嚴(yán)格挑選和嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)自趙霽過(guò)程，配方中使用的水、碗必須很干凈，趙霽后要嚴(yán)格過(guò)濾菌

7、。2天然培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基是指通過(guò)動(dòng)物體液或組織分離提取的培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立初期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都使用天然培養(yǎng)基。但是天然培養(yǎng)基制作過(guò)程復(fù)雜，布局之間的差異大小，逐漸被合成培養(yǎng)基取代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清。血清(serum)，血清瘤：主要是牛血清，即使培養(yǎng)了一些特殊細(xì)胞，也使用血清，馬血清等。牛血清分為犢牛血清(calf serum，CS)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)。胎牛血清應(yīng)在剖宮產(chǎn)胎牛中提取。新生兒小牛血清在出生24小時(shí)內(nèi)從新生兒牛身上提取。小牛血清是從出生10-30天的小牛身上提取的。為什么主要是牛血清？f

8、etal bovine serum、FBS、When the media is needed、Add 50-ml of FBS and 5-ml of antibiotics to one of the portions . this completedoes it cause any problem for cell growth？與胎牛血清相關(guān)的問(wèn)題，胎牛血清： (進(jìn)口血清)需要剖腹產(chǎn)。國(guó)內(nèi)企業(yè)往往做不到，因此在出生后2天內(nèi)，他們將采血稱為燃燒血清。血清的主要作用是提供激素和多種生長(zhǎng)因子的基本營(yíng)養(yǎng)素，提供結(jié)合蛋白，提供接觸和伸展因子，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞有某種保護(hù)作用。血清

9、中含有抗蛋白酶成分，起中和作用。牙齒效果是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在目的是利用血清終止胰酶的消化作用。細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)，大部分細(xì)胞、體內(nèi)狀態(tài)、血清不是接觸的生理液體，而是在損傷愈合和血液凝固過(guò)程中接觸血清，因此使用血清可以使某些細(xì)胞改變體內(nèi)正常狀態(tài)。血清能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長(zhǎng)(纖維細(xì)胞)，抑制其他種類(lèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)(表皮細(xì)胞)。血清中含有對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，由于血清的缺點(diǎn)(繼續(xù))、動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)也不同，所以每批的質(zhì)量差異很大。在采訪中，可能對(duì)支原體、病毒和細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果不可靠。血清的使用使實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化變得困難，其中蛋白質(zhì)使一些轉(zhuǎn)基因藥物蛋白的分離和純化變得困難。在大規(guī)

10、模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越難，價(jià)錢(qián)費(fèi)用高是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與生產(chǎn)成本的主要部分之一。血清的使用，使用前處理：大部分血清在使用前必須經(jīng)過(guò)滅活處理，即56水浴鍋處理30分鐘。滅活的目的是滅活血清的補(bǔ)體和支原體。有人指出，血清一旦消失，對(duì)細(xì)胞有利的成分(如生長(zhǎng)因子)也可能丟失，因此血清不用經(jīng)過(guò)不死的過(guò)程，直接用于培養(yǎng)。前提是確認(rèn)血清不含補(bǔ)體成分。血清的儲(chǔ)存，儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存在-20，同時(shí)要避免重復(fù)的董潔融化。購(gòu)買(mǎi)大包裝的血清后，應(yīng)先進(jìn)行滅活處理，然后分成小包裝-20儲(chǔ)存，使用前融化。融化的時(shí)候最好現(xiàn)在放在4。融化的血清如果長(zhǎng)時(shí)間保存在4，就會(huì)渡邊杏，應(yīng)盡快使用。3合成培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基包含無(wú)機(jī)鹽、氨

11、基酸、維生素和碳水化合物的四種茄子主要物質(zhì)。普通合成培養(yǎng)基，(1) MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列，(2) DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列，(3) RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列，(4) 199細(xì)胞培養(yǎng)基系列，(5)水解牛奶蛋白質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，(6)歐氏鹽，(7)開(kāi)發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。要使用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)血清，以下說(shuō)法是正確的。在使用A:血清之前必須銷(xiāo)毀B:到目前為止，所有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)血清C:血清中含有抗蛋白酶成分，具有中和作用，可以用血清阻止胰蛋白酶的消化。D:血清的使用有利于實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化。4.3細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)，4.3.1原代培養(yǎng)，1取材組織：胚鼠皮膚和粘膜血細(xì)胞內(nèi)臟和實(shí)體瘤

12、，2組織細(xì)胞分離，機(jī)械法：離心，截肢分離，機(jī)械分散法消化法：胰酶組織塊培養(yǎng)法單層細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，原代培養(yǎng)，錄像，組織塊培養(yǎng)法，組織塊培養(yǎng)法取9-11日的雞胚用酒精消毒，從初順工作臺(tái)上小心取出雞胚，放入培養(yǎng)皿中，去除頭部和尾部2。胚胎用雙抗PBS沖洗23次，切成12mm3的小塊，放入適量的大小三角瓶(或試管，燒杯)。3.每個(gè)雞胚中加入約5mL的EDTA-胰酶消化液，在室溫下消化10min。雞胚胎纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)(繼續(xù))，4 .小牛血清停止消化，收集細(xì)胞顯液，未完全消化的組織塊可以再次消化。5.收集的細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)100網(wǎng)狀過(guò)濾器，1000 rpm離心5分鐘，上清。6.細(xì)胞沉淀用DMEM培

13、養(yǎng)液再懸浮，取少量細(xì)胞懸液帶帕蘭染色，計(jì)算細(xì)胞活力。7.以5105/mL的密度接種培養(yǎng)瓶(30mL細(xì)胞液/雞胚)，在38.5，5%CO2濃度，飽和濕度條件下培養(yǎng)。，4.3.2代培養(yǎng)，一次培養(yǎng)成功后，應(yīng)將培養(yǎng)物分成小部分，重新接種到其他培養(yǎng)基(病)中，然后培養(yǎng)。牙齒的過(guò)程稱為世代或栽培。的過(guò)程。的過(guò)程。的一部分。或者說(shuō)，它的過(guò)程稱為“代代”(passage)或“栽培”(subculture)在單層培養(yǎng)的情況下，80%加入或剛剛加入的細(xì)胞是比較理想的繼承階段。壁細(xì)胞傳代、壁細(xì)胞傳代消化過(guò)程圖、胰酶消化、懸浮細(xì)胞傳代、Wave-bioreactor、懸浮細(xì)胞傳代、雞胚胎纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)、原代培養(yǎng)的細(xì)

14、胞鋪設(shè)病底時(shí)(約2天)，可以將原培養(yǎng)液吸出，然后將細(xì)胞傳入PBS3.放入0.2毫升的消化液消化。消化的程度可以倒著用顯微鏡觀察。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞突起收縮，細(xì)胞間的間距增大，細(xì)胞幾乎收縮成圓形的程度。雞胚胎纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)(繼續(xù))，4 .吸收消化液，適量加入含有小牛血清的培養(yǎng)液，輕輕吹培養(yǎng)瓶底部，將消化的細(xì)胞從瓶底取出，分散到單個(gè)細(xì)胞中。5.細(xì)胞懸液收集，1000 rpm離心5分鐘，放棄聽(tīng)力。6.用培養(yǎng)液重新計(jì)算細(xì)胞懸浮，細(xì)胞活力和密度，以5105/mL密度(1: 3)接種于培養(yǎng)瓶，在38.5，5% CO2濃度，飽和濕度條件下培養(yǎng)。4.4細(xì)胞株和細(xì)胞株的建立，細(xì)胞株和細(xì)胞株的種類(lèi)，原代培養(yǎng)細(xì)胞株克隆細(xì)胞株二倍體細(xì)胞遺傳缺陷細(xì)胞株或株，通過(guò)從生物驗(yàn)證的細(xì)胞株分離或篩選為單細(xì)胞的方法形成的細(xì)胞群，稱為細(xì)胞株。在原細(xì)胞株中進(jìn)一步分離出與原細(xì)胞株不同的細(xì)胞群，非常(Substrain)，細(xì)胞株，細(xì)胞株，正常細(xì)胞培養(yǎng)世代數(shù)量有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生變異的細(xì)胞才能無(wú)限