第三章細胞生物學(xué)研究方法.ppt

1、第3章，細胞生物學(xué)的研究方法，觀察(原文P143)自從荷蘭學(xué)者Leeuven hoek在1680年第一次用單個顯微鏡看到酵母活細胞(單透鏡)以來，人們一直在嘗試改革和發(fā)展觀察方法，以研究細胞的更深層次的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。今天，人們擁有原子級高分辨率的掃描隧道顯微鏡。同時，人們創(chuàng)造了一系列詳細分析細胞成分和生理活動的方法和手段，揭示了細胞的各種結(jié)構(gòu)以及生物大分子在細胞中的功能和作用。為了提供大量均勻的細胞作為生物研究材料，人們發(fā)展了一系列的細胞培養(yǎng)技術(shù)。細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察技術(shù)、細胞成分和功能分析技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學(xué)發(fā)展的三大技術(shù)手段。第一節(jié)細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的觀察方法。普通光學(xué)顯微鏡的分辨能力各種

2、顯微鏡識別微觀物體的能力通常用分辨能力的概念來表示。分辨率是指能夠區(qū)分兩個接近點的最小距離。兩點之間的距離越小，顯微鏡的分辨率越高。分辨率也稱為分辨率。顯微鏡的分辨率是由物鏡決定的。它與物鏡的孔徑比和照明光的波長直接相關(guān)。分辨率可計算如下：0.61(r=-(a)na(sin a1/2)r-鏡像角度(小于180)，因此Sin1/2的最大值也小于1。暗場顯微鏡暗場顯微鏡是因為照明光不能在視野中直接看到，只能看到被檢查物體散射或衍射的光。因此，視野是黑暗的。由于光從被檢查物體的表面散射，我們可以在黑暗的視野中觀察被檢查物體的形狀和運動。如上所述，普通顯微鏡的最高分辨率是0.2微米，而暗顯微鏡不能分辨

3、物體的細微結(jié)構(gòu)，但它能看到0.004微米以上的粒子的存在。這是普通光學(xué)顯微鏡所不具備的特征。澤尼克相差顯微鏡。f在20世紀(jì)30年代提出了相差顯微鏡的原理和設(shè)計，并在20世紀(jì)40年代開始制造和銷售相差顯微鏡。由于有了相差顯微鏡，上述困難可以在一定程度上克服，并且可以直接觀察活細胞的結(jié)構(gòu)變化。熒光顯微鏡有些物質(zhì)在受到紫外線照射時會發(fā)出熒光(可見光)。這種物質(zhì)被稱為熒光物質(zhì)。例如，維生素A、核黃素和硫胺素是細胞中的天然熒光物質(zhì)。這些熒光物質(zhì)在細胞中的分布可以通過熒光顯微鏡觀察到。另外，加入熒光染料(如中性紅、甲基綠、吖啶橙、吖啶黃、剛果紅等。)能誘導(dǎo)細胞內(nèi)某些物質(zhì)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光。例如，當(dāng)固定

4、切片標(biāo)本用吖啶橙染色時，細胞中的核糖核酸會發(fā)出紅色熒光，而脫氧核糖核酸在紫外線照射下會發(fā)出綠色熒光。電子顯微鏡中可見光的波長限制了普通光學(xué)顯微鏡的分辨率。人們正在考慮可能的替代光源。1926年，有人發(fā)現(xiàn)了磁場對電子束的聚焦效應(yīng)，然后羅斯卡借助磁線圈將電子束聚焦在盡可能小的一個點上。這兩項研究成果為制作電子顯微鏡奠定了基礎(chǔ)。1831年，羅斯卡和其他人通過實驗證明，像光學(xué)成像的幾何原理一樣，被電子照射的物體也可以用磁電透鏡以二次放大的形式顯示出來。1933年，羅斯卡制造了第一臺電子顯微鏡，它被認(rèn)為是各種當(dāng)代電子顯微鏡的鼻祖。1939年，羅斯卡大大改進了電子顯微鏡，西門子開始大規(guī)模生產(chǎn)，并成功地將電

5、子顯微鏡推向市場。1986年，羅斯卡和掃描隧道顯微鏡的發(fā)明者寧濱一起被授予諾貝爾物理學(xué)獎。拉斯卡因在24歲時發(fā)明了電子顯微鏡而在80歲時獲得了這一榮譽。他可能是歷史上最老、最年輕的諾貝爾獎獲得者。電子顯微鏡使用電子束作為照明光源。電子束的長波長比光波的短。其次，電子顯微鏡使用電子透鏡。光學(xué)透鏡是由玻璃制成的可見材料透鏡。相反，電子透鏡不是可見的物質(zhì)透鏡，而是由磁性或電性構(gòu)成的局部空間。電子束是如何成像的？它與光學(xué)圖像的形成有何不同？在光學(xué)顯微鏡中，成像的對比度，即亮度差，是由被檢查物體的不同結(jié)構(gòu)吸收的不同強度的光引起的。那么電子束是如何形成圖像的呢？它與光學(xué)圖像的形成有何不同？在光學(xué)顯微鏡中，

6、成像的對比度，即亮度差，是由被檢查物體的不同結(jié)構(gòu)吸收的不同強度的光引起的。電子顯微鏡成像的原因是入射電子與物質(zhì)原子碰撞產(chǎn)生散射，被檢測的不同部位散射程度不同，從而形成電子圖像的陰影。電子束的散射程度由物體的密度和厚度與加速電壓的乘積決定。6掃描隧道顯微鏡。人類永遠不會停止探索微觀世界。在電子顯微鏡發(fā)明了大約半個世紀(jì)之后，寧濱等人于1981年發(fā)明了掃描隧道顯微鏡。它的成像原理與光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡完全不同?；诹孔恿W(xué)的原理，研究人員開發(fā)了一系列高分辨率顯微鏡。這些發(fā)明為微觀世界打開了一扇門又一扇門，使人類真正進入了納米世界。掃描隧道顯微鏡探針有一個探針，它的尖端只有一個原子那么大。探針尖端接

7、近但不接觸被觀察樣品的表面，并同時掃描。根據(jù)量子物理學(xué)的原理，當(dāng)針尖上的原子與樣品表面的原子之間的距離小于1納米時，針尖與樣品之間會發(fā)生隧穿效應(yīng)，即產(chǎn)生隧穿電流。通過記錄隧穿電流的變化，可以獲得樣品表面原子的排列并轉(zhuǎn)換成圖像。掃描隧道顯微鏡具有其他顯微鏡無法比擬的功能和特點：(1)分辨率高。()有移動的能力。掃描隧道顯微鏡不僅可以直接觀察材料表面原子的排列，還可以通過探針移動材料表面的原子或分子，使人們可以根據(jù)自己的意愿在原子水平上重建或構(gòu)建新材料。(3)具有蝕刻能力。掃描隧道顯微鏡可以蝕刻材料表面，像紅樓夢這樣的書可以通過計算大頭針的大小來記錄。(4)具有在各種情況下工作的能力。掃描隧道顯微

8、鏡可以在各種條件下工作，如真空和大氣，這對生物學(xué)研究尤為重要。(5)在不損傷樣品的情況下，掃描隧道顯微鏡在工作過程中不接觸樣品或受到高能電子束的轟擊，因此可以避免樣品的變形。在第二節(jié)中，細胞成分和功能的分析方法大致可以分為三種類型：第一種方法是將細胞和大分子分開進行研究，即分離分析法；第二種是在不破壞細胞或成分的情況下原位研究成分和功能，即原位分析，第三種是在細胞或細胞成分的生存條件下的動態(tài)分析。當(dāng)然，觀察方法和分析方法之間沒有嚴(yán)格的界限。目前，流式細胞術(shù)和分選(FCM，F(xiàn)CS)是一項新的開創(chuàng)性技術(shù)，可用于分離細胞。流式細胞儀一小時可收集1.8億個細胞，純度可達90.99%。1分鐘內(nèi)可測量10

9、000個細胞的脫氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白質(zhì)含量和細胞體積。該儀器用途廣泛，但非常昂貴(原裝P167)。細胞器和生物大分子的分離技術(shù)離心機是一種利用離心力將顆粒從中心向外推出的機器。當(dāng)離心力超過地球的重力時，懸浮在液體中的粒子將離開中心并向外沉降。20世紀(jì)20年代，瑞典化學(xué)家特奧多爾斯韋德貝里發(fā)明了一種超速離心機，它能以每分鐘10萬轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生相當(dāng)于幾十萬倍重力的離心力。超速離心機的出現(xiàn)極大地促進了細胞生物學(xué)的研究。離心技術(shù)有兩個主要參數(shù)，一個是離心力，通常用離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)來表示。在文獻中，離心力(g)經(jīng)常被直接使用。另一個是沉降系數(shù)，用來表示大分子的沉降速度。各種大分子

10、顆粒都有一定的沉降系數(shù)。為了紀(jì)念諾貝爾獎獲得者斯維德伯格，沉降系數(shù)的單位以他的名字命名，即斯維德伯格單位，簡稱S。1.差速離心差速離心利用不同離心速度產(chǎn)生的不同離心力，從不同顆粒中分離出不同的亞細胞成分。在離心場中，不同大小的顆粒以不同的速度沉降到離心管的底部。當(dāng)離心力不高，離心時間不長時，細胞核先沉入管底。取出上清液，離心并增加離心力，這時，線粒體可以被分離，然后繼續(xù)增加離心力，最后，核糖體可以被分離。(原件P168)，如何鑒定分離物質(zhì)的純度？通常有兩種方法，一種是用電子顯微鏡進行形態(tài)學(xué)鑒定。利用各種細胞器或特殊酶分子的特性進行生化分析更為方便。2.密度梯度離心這種方法利用離心溶液形成梯度來

11、保持重力的穩(wěn)定性和抑制對流。這需要加入化學(xué)惰性物質(zhì)，如蔗糖、甘油和鹽(如氯化銫和氯化銣)。這些物質(zhì)不影響被分離物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，并且被分離物質(zhì)的密度必須在梯度柱密度的范圍內(nèi)。高速離心后，分離出的不同密度的物質(zhì)將集中在等密度區(qū)并相互分離。密度梯度離心法(密度梯度離心法)這種方法利用離心溶液形成梯度來保持重力的穩(wěn)定性和抑制對流。這需要加入化學(xué)惰性物質(zhì)，如蔗糖、甘油和鹽(如氯化銫和氯化銣)。這些物質(zhì)不影響被分離物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，并且被分離物質(zhì)的密度必須在梯度柱密度的范圍內(nèi)。高速離心后，分離出的不同密度的物質(zhì)將集中在等密度區(qū)并相互分離。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離形成的囊泡稱為微粒體，這給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究帶來了

12、極大的便利。正是微粒體的分離使我們在分泌蛋白的合成機制方面取得了許多成果。例如，在蛋白質(zhì)合成機制的研究中，發(fā)現(xiàn)核糖核酸可以在粗細胞提取物中翻譯成蛋白質(zhì)。然后逐步分離粗提物，依次獲得核糖體、tRNA和各種酶。這些物質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)嗎？我們可以在這個系統(tǒng)中加入或不加入各種純成分，這樣我們就可以研究每個成分在整個過程中起著準(zhǔn)確的作用。事實上，分離分析正在構(gòu)建一個無細胞系統(tǒng)。該系統(tǒng)來源于細胞，但不具有完整的細胞結(jié)構(gòu)。它含有一些細胞提取物，可以進行正常的生物反應(yīng)。這樣，細胞中的各種生物過程可以彼此分離，而不受細胞中復(fù)雜副反應(yīng)的干擾，因此可以確定這些生物過程。密度梯度離心是基于被檢測物體浮力密度的差異

13、，而不是其大小。例如，線粒體、溶酶體或過氧化物酶體大小相似，但密度不同，因此我們可以根據(jù)浮力密度進一步分離它們。該方法的準(zhǔn)確度和靈敏度令人信服。早在1957年，人們就使用氯化銫密度梯度離心技術(shù)將15N標(biāo)記的細菌DNA從未標(biāo)記的細菌DNA分子中分離出來。這個經(jīng)典實驗直接證明了脫氧核糖核酸的半保守復(fù)制。兩個細胞的原位分析除了通過分離研究細胞外，人們還開發(fā)了一系列原位分析細胞的方法。顧名思義，這種方法要求待測物質(zhì)必須保留在細胞的原始位置。一般的細胞化學(xué)方法屬于這一類。例如，為了確定細胞成分，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)，一些顯色劑通常與被測物質(zhì)中的一些特殊基因結(jié)合，細胞中各種物質(zhì)的分布和含量可以通過這

14、種結(jié)合產(chǎn)生的顏色來判斷。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)，變成黑色，證明脂肪滴的存在。用氮汞試劑與組織中蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)形成紅色沉淀。這就是著名的米隆反應(yīng)。原位分析方法很多，我們只介紹幾種細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的定位和定量分析方法。1.費爾根反應(yīng)1924年，德國化學(xué)家羅伯特費爾根發(fā)現(xiàn)了一種研究核酸的方法，這種方法只對脫氧核糖核酸著色，而不對核糖核酸著色。他發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核酸在細胞核中，尤其是在染色體中。通過這種方式，他證明了脫氧核糖核酸在植物和動物細胞核中無處不在。2.原位雜交技術(shù)福爾根技術(shù)可以讓我們知道DNA在細胞中的位置，但如果我們想知道染色體上或細胞中特定核苷酸序列的確切位置，福爾根技術(shù)

15、什么也做不了，這就需要原位雜交技術(shù)。2.原位雜交技術(shù)Folgen技術(shù)可以使我們知道DNA在細胞中的位置，但是如果我們想知道染色體上或細胞中特定核苷酸序列的確切位置，F(xiàn)olgen技術(shù)什么也做不了，這就需要原位雜交技術(shù)。原位雜交是一種核酸分子雜交技術(shù)。原理是兩個具有互補核苷酸序列的單鏈核苷酸分子片段。在某些條件下，脫氧核糖核酸、脫氧核糖核酸或核糖核酸雙鏈分子是由氫鍵形成的。1974年，Steffensen等人從HeLa細胞的核糖體中分離出5SrRNA，并將其制成帶有125I標(biāo)記的探針，檢測了5SrRNA基因在染色體上的位置。具體過程如下：首先，將載玻片上人細胞的中期染色體原位變性，加入探針。此時，

16、探針只能與產(chǎn)生它的模板互補，即分子雜交，而不能與其他部分互補。放射自顯影曝光后2個月，發(fā)現(xiàn)在所有產(chǎn)生的基因組中，1對1染色體被標(biāo)記在短臂末端，這表明5SrRNA基因位于1號染色體短臂末端。原位雜交最初是在光學(xué)顯微鏡的水平上發(fā)展起來的。近年來，隨著免疫電鏡技術(shù)的發(fā)展，原位雜交技術(shù)得到了發(fā)展。電子顯微鏡下原位雜交和光學(xué)顯微鏡下原位雜交的基本原理是相同的。區(qū)別在于探針的標(biāo)記不同。一般來說，一些小分子如生物素被用來代替同位素或熒光素來標(biāo)記特定的核苷酸序列，從而制成原位雜交的探針。然后，用與膠體金相連的生物素特異性抗體對原位雜交樣品進行免疫反應(yīng)，以便在電子顯微鏡下觀察探針的位置。近年來發(fā)展起來的免疫細胞化學(xué)開創(chuàng)