液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用.ppt

1、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用,中心實(shí)驗(yàn)室,簡介,色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。 色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補(bǔ)充，分析不同性質(zhì)的化合物。,液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:,氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測

2、定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。,現(xiàn)代有機(jī)和生物質(zhì)譜進(jìn)展,在20世紀(jì)80及90年代，質(zhì)譜法經(jīng)歷了兩次飛躍。在此之前，質(zhì)譜法通常只能測定分子量500Da以下的小分子化合物。20世紀(jì)70年代，出現(xiàn)了場解吸（FD）離子化技術(shù)，能夠測定分子量高達(dá)15002000Da的非揮發(fā)性化合物，但重復(fù)性差。20世紀(jì)80年代初發(fā)明了快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），能夠分析分子量達(dá)數(shù)千的多肽。 隨著生命科學(xué)的發(fā)展，欲分析的樣品更加復(fù)雜，分子量范圍也更大，因此，電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸離

3、子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）應(yīng)運(yùn)而生。,目前的有機(jī)質(zhì)譜和生物質(zhì)譜儀，除了GC-MS的EI和CI源，離子化方式有大氣壓電離（API）（包括大氣壓電噴霧電離ESI、大氣壓化學(xué)電離APCI、大氣壓光電離APPI）與基質(zhì)輔助激光解吸電離。前者常采用四極桿或離子阱質(zhì)量分析器，統(tǒng)稱API-MS。后者常用飛行時(shí)間作為質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特點(diǎn)是可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離手段聯(lián)用，擴(kuò)展了應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析、食品檢驗(yàn)、組合化學(xué)、有機(jī)化學(xué)的應(yīng)用等；MALDI-TOF-MS的特點(diǎn)是對鹽和添加物的耐

4、受能力高，且測樣速度快，操作簡單。,質(zhì)譜原理簡介：,質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。,常見術(shù)語:,質(zhì)荷比: 離子質(zhì)量(以相對原子量單位計(jì))與它所帶電荷(以電子電量為單位計(jì))的比值,寫作m/Z. 峰: 質(zhì)譜圖中的離子信號(hào)通常稱為離子峰或簡稱峰. 離子豐度: 檢測器檢測到的離子信號(hào)強(qiáng)度. 基峰: 在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強(qiáng)度最大的離子峰稱作基峰. 總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準(zhǔn)分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子,總離子流圖:,在選定

5、的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強(qiáng)度的總和對時(shí)間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖.,質(zhì)量色譜圖,指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強(qiáng)度對時(shí)間所作的圖. 利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時(shí)是LC/MS測定中最有用的方式。當(dāng)樣品濃度很低時(shí)LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時(shí)，根據(jù)得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗(yàn)直接進(jìn)樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進(jìn)行MRM等其他掃描方式的測定時(shí)可作為參考。,質(zhì)量色譜圖,總離子流圖,準(zhǔn)分子離子:,指與分子存在簡單關(guān)系的離子，通過它可以確定分子量.液質(zhì)中最常見的準(zhǔn)分子離子

6、峰是M+H+ 或M-H- . 在ESI中, 往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18.稱準(zhǔn)分子離子,表示為:M+H+,M+Na+等,碎片離子：,準(zhǔn)分子離子經(jīng)過一級(jí)或多級(jí)裂解生成的產(chǎn)物離子. 碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān),數(shù)目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。,Ephedrine, MW = 165,多電荷離子：,指帶有2個(gè)或更多電荷的離子,常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子.有機(jī)質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會(huì)形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的.采用電噴

7、霧的離子化技術(shù), 可產(chǎn)生帶很多電荷 的離子,最后經(jīng)計(jì) 算機(jī)自動(dòng)換算成單 質(zhì)/荷比離子。,同位素離子,由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子. 各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便, 還可利用穩(wěn)定同位素合成標(biāo)記化合物,如:氘等標(biāo)記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化合物結(jié)構(gòu),反應(yīng)歷程等,如何看質(zhì)譜圖：,(1)確定分子離子,即確定分子量 氮規(guī)則：含偶數(shù)個(gè)氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù)，含奇數(shù)個(gè)氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù)。與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差，凡質(zhì)量差在38和1013

8、，2125之間均不可能，則說明是碎片或雜質(zhì)。,(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學(xué)式,高分辨質(zhì)譜可以由分子量直接計(jì)算出化合物的元素組成從而推出分子式 低分辨質(zhì)譜利用元素的同位素豐度，例:,(3)峰強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系,豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強(qiáng)，含支鏈的地方易斷，這同有機(jī)化學(xué)基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。,不同類型有機(jī)物有不同的裂解方式 相同類型有機(jī)物有相同的裂解方式,只是質(zhì)量數(shù)的差異 需要經(jīng)驗(yàn)記憶。,質(zhì)譜解析的一般步驟,(適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)是高分辨質(zhì)譜圖得到元素組成更好) (1)核對獲得的譜

9、圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(dāng) (2)綜合樣品其他知識(shí)：例如熔點(diǎn)，沸點(diǎn)，溶解性等理化性質(zhì)，樣品來源，光譜，波譜數(shù)據(jù)等.,(3) 盡可能判斷出分子離子。 (4) 假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬：高質(zhì)量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31.意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3. (5)假設(shè)一個(gè)分子結(jié)構(gòu)，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質(zhì)譜進(jìn)行對比。,有機(jī)質(zhì)譜的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn): (1)定分子量準(zhǔn)確，其它技術(shù)無法比。 (2)靈敏度高，常規(guī)10-710-8g,單離子檢測可達(dá)10-12g。 (3)快速，幾分甚至幾秒。 (4)

10、便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效, 其它技術(shù)無法勝任。 (5)多功能，廣泛適用于各類化合物。,局限性:,(1)異構(gòu)體，立體化學(xué)方面區(qū)分能力差。 (2)重復(fù)性稍差，要嚴(yán)格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動(dòng)手，須專人操作。 (3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，污染等問題。 (4)價(jià)格稍顯昂貴，操作有點(diǎn)復(fù)雜。,質(zhì)譜儀器：,質(zhì)譜儀由以下幾部分組成 數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 檢測接收器 真空系統(tǒng),真空系統(tǒng),質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。

11、利用這個(gè)特點(diǎn)，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而得到分子量。 由機(jī)械真空泵(前極低真空泵)，擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組，抽取離子源和分析器部分的真空。 只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度低。,進(jìn)樣系統(tǒng),把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括：直接進(jìn)樣，GC，LC及接口，加熱進(jìn)樣，參考物進(jìn)樣等。,離子源,使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置，并對離子進(jìn)行加速使其進(jìn)入分析器，根據(jù)離子化方式的不同，有機(jī)質(zhì)譜中常用的有如下幾種，其中EI，ESI最常用。,EI(Electron Impact Ionization):電子轟擊

12、電離硬電離。 CI(Chemical Ionization):化學(xué)電離核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。 FD(Field Desorption):場解吸目前基本被FAB取代。 FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轟擊或者銫離子 (LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜 ) 。 ESI(Electrospray Ionization):電噴霧電離屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質(zhì)分子多肽等) APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大氣壓化學(xué)電離同上，更適宜做弱極性小分子。 APPI(Atmospheric P

13、ressure PhotoSpray Ionization):大氣壓光噴霧電離同上，更適宜做非極性分子。 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時(shí)間質(zhì)譜和FT-MS，特別適合蛋白質(zhì)，多肽等大分子,其中ESI，APCI，APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API),實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的離子源:,ESI電噴霧電離源 APCI大氣壓化學(xué)電離源,電噴霧（ESI）的特點(diǎn),通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，由于質(zhì)譜儀測定質(zhì)/荷比，因此質(zhì)量范圍只有幾千質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀可測定質(zhì)量數(shù)十幾萬的生物大分子。

14、電噴霧電離是最軟的電離技術(shù)，通常只產(chǎn)生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內(nèi)CID）測定化合物結(jié)構(gòu)。,大氣壓化學(xué)電離（APCI）特點(diǎn),大氣壓化學(xué)電離也是軟電離技術(shù)，只產(chǎn)生單電荷峰，適合測定質(zhì)量數(shù)小于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應(yīng)高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動(dòng)相；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂。,電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較,電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成MH+或M-H-離子。 樣品流速：APCI源可從0.2到2

15、 mlmin；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1 mlmin. 斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解. 靈敏度：通常認(rèn)為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。 多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子,NanoSpray 離子源,專門設(shè)計(jì)的 NanoSpray 離子源特別適合于做微量的生化樣品，其流速范圍可從 5nLmin到luLmin。一滴樣品就可做數(shù)小時(shí)的分析?？稍谧钚〉臉悠废牧肯芦@得最大靈敏度。靈敏度可高達(dá)fmole。并可直接與微孔HPLC聯(lián)用。,正負(fù)離子模式:,一般的商品儀

16、器中,ESI和APCI接口都有正負(fù)離子測定模式可供選擇。 根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇，也可兩種模式同時(shí)進(jìn)行,質(zhì)量分析器:,是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。,質(zhì)量分析器的分類：,雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector). 四極質(zhì)譜儀(Q). 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF). 離子阱質(zhì)譜儀（TRAP） 付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS). 四極+TOF（Q-TOF） 串列式多級(jí)質(zhì)譜儀三重四極（QqQ） (MS/MS) TOF+TOF,進(jìn)行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類,第一類儀器利用質(zhì)譜在空間中的順

17、序，是由兩臺(tái)質(zhì)譜儀串聯(lián)組裝而成。即前面列出的串列式多級(jí)質(zhì)譜儀。 第二類利用了一個(gè)質(zhì)譜儀時(shí)間順序上的離子儲(chǔ)存能力，由具有存儲(chǔ)離子的分析器組成，如離子回旋共振儀（ICR）和離子阱質(zhì)譜儀。但不能進(jìn)行母離子掃描或中性丟失。,實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型：,串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS) ： 三重四極（QqQ） 離子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q3,QqQ儀器可以方便的改變離子的動(dòng)能，因此掃描速度快，體積小，常作為臺(tái)式進(jìn)入常規(guī)實(shí)驗(yàn)室，缺點(diǎn)是質(zhì)量范圍及分辨率有限，不能進(jìn)行高分辨測定，只能做到單位質(zhì)量分辨。（通過高分辨能得到化合物的分子式）,在液質(zhì)聯(lián)機(jī)中使用的碎片化手段，能量

18、都是以碰撞的形式輸送給分子離子，這個(gè)能量足以使得處在能量亞穩(wěn)態(tài)分子中的某些化學(xué)鍵斷裂并使一些特定的分子發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。,碰撞誘導(dǎo)解離CID質(zhì)譜：,選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進(jìn)入碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(碰撞氣體： N2、He、Ar、 Xe、CH4等) ，發(fā)生離子分子碰撞反應(yīng)，從而產(chǎn)生子離子，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜，一般稱做CID (collision-induced dissociation)譜,影響CID質(zhì)譜的因素：,較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類，壓力，離子的能量，儀器的配置以及離子電荷狀態(tài) 由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品，任何一個(gè)給定

19、的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質(zhì)譜，尤其是各個(gè)離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的。因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用，只能進(jìn)行人工解析或自己建庫。,大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子，其主要的碎片應(yīng)由化學(xué)鍵的誘導(dǎo)斷裂和重排反應(yīng)來產(chǎn)生，所以在EI質(zhì)譜解析中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的解釋。,檢測接收器：,接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板,數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng),將接收來的電信號(hào)放大、處理并給出分析結(jié)果及控制質(zhì)譜儀個(gè)部分工作。 從幾伏低壓到幾千伏高壓。,LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化,1.接口的選擇： ESI適合于中等極性到強(qiáng)極

20、性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)） APCI不適合可帶多個(gè)電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。,2.正、負(fù)離子模式的選擇：,選擇的一般原則為： 正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式。 負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化。樣品中含有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式。,3.流動(dòng)相的選擇,常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)

21、酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。 LCMS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會(huì)抑制離子源的信號(hào)和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸銨10一5 mmol/l。 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。,4.流量和色譜柱的選擇,不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lmlmin，建議使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適

22、。 為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時(shí)UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時(shí)使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時(shí)間。,5.輔助氣體流量和溫度的選擇,霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生。 操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20 左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。 選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成，有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。,樣品的預(yù)處理：,為什么要進(jìn)行樣品

23、的預(yù)處理： 從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對分析結(jié)果的干擾。 要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。,樣品的預(yù)處理常用方法,a）超濾 b）溶劑萃取去鹽 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）凈化去鹽 e）色譜分離 反相色譜分離 親和技術(shù)分離 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化,化合物鑒別,全掃描方式（Q1掃描） 全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離

24、子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。 子離子分析（ MS/MS ） 子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級(jí)譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。 子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。,用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息,正離子方式常出現(xiàn)如下離子: -Na 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher th

25、an M+H -Li 6 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher than M+H -ACN 40 Da. higher than M+H 2M+H,2M+Na等 負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子: -TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background) -Acetate 60 Da. higher then M-H -Formic 46 Da. higher then M-H -Cl 36 Da. higher than M-H,影響分子量測定的因素,1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，

26、除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。 2）氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加。 3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。 4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些 5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱 6）合適的電壓：DP電壓高時(shí)，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時(shí)回使多電荷離子比例低，多聚體也減少 7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時(shí)，競爭使被測物離子化不好，同時(shí)使LC分離不好 9）樣品濃度不夠，有時(shí)需要濃縮,分子量測定中的誤判,溶劑中的雜質(zhì) 來自于塑料添加劑的峰 樣品容器不干凈，

27、常見表面活性劑的峰 進(jìn)樣系統(tǒng)污染 樣品在源內(nèi)碎裂，形成碎片離子,LC-MS中常見的本底離子,m/z 50-150, 溶劑離子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 m/z149, 管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子 m/z 279, 管路中鄰苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子 m/z 384, 瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子 m/z391, 管路中鄰苯二甲酸二辛酯, C24H38

28、O4H+, 391.2843 m/z413, 鄰苯二甲酸二辛酯+鈉, C24H38O4Na+, 413.2668 m/z 538, 乙酸+氧 +鐵（噴霧管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793,分子量測定失敗的原因,a）流動(dòng)相不合適 b）不揮發(fā)性鹽的影響 c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多 d) 樣品濃度不夠 e）pH值不合適 f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂,目標(biāo)化合物分析,（1）選擇離子監(jiān)測（SIM） SIM用于檢測已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。 若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測，那么可以同時(shí)

29、測定幾種離子.,目標(biāo)化合物分析,（1）選擇離子監(jiān)測（SIM） SIM用于檢測已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。 若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測，那么可以同時(shí)測定幾種離子.,（3）母離子掃描,母離子分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過程中會(huì)生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。,(4)中性丟失掃描,中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測項(xiàng)目。也可以幫助進(jìn)行未知物結(jié)構(gòu)判斷，例如有中性丟失18D

30、a的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。,各種掃描方式的原理解釋：,Q1 Full Scan (Start Stop)(Q1全掃描) Q1 always used as single MS analyzer Used primarily for ident. of precursor ion,SIM - Selected Ion Monitoring(選擇離子監(jiān)測),Used to optimize analyzer for specific ions SIM used for quantitative analyses Q1 SIM used to

31、 “optimize” precursor ion Maximize signal in preparation for MS/MS,Product Ion Scan(子離子掃描),After identification, the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CID Q1 is fixed, Q3 sweeps a given mass range Used for structural elucidation First step to developing quantitative met

32、hod,m3+ scanned,m1+ fixed,Example of Product Ion Spectrum,Ephedrine, MW = 165,Precursor Ion Scan(母離子掃描),Q1 sweeps a given mass range, Q3 is fixed Used to determine the “origin” of particular product ion(s) created in the collision cell Frequently used for drug metabolite identification (common produ

33、ct ion observed in the metabolites),m3+ fixed,m1+ scanned,Example of Precursor Ion Spectrum,Fragmentation,When an Ion fragments the following formulas apply: Positive mode (Parent)+ A+ + B Neutral Negative mode (Parent)- A- + B Neutral,Neutral Loss Scan(中性丟失掃描),Q1 & Q3 both scan a given mass range b

34、ut with a constant difference between ranges scanned Spectrum indicates which ions lose a neutral species equal to Q1 - Q3 difference Complement to Precursor Ion Scan Neutral “gain” indicates a multiply charged precursor ion was fragmented,m1+ scanned,m3+ scanned,Multiple Reaction Monitoring (MRM),M

35、any precursor to product ion pairs can be monitored (A-B, A-B, etc.) MRM is the best way to maximize signal intensity of product ions MRM used primarily for quantitation,Why LC/MS/MS for Quantitation ?,Retention Time,Retention Time,Intensity,Intensity,Increased Sensitivity & Specificity,儀器介紹:,4000QT

36、RAPTM四極桿-四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司最新推出的、具有革新性設(shè)計(jì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀。它把四極桿-線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)首次結(jié)合在一起，既保留了串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的優(yōu)點(diǎn)如母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）、MRM定量功能，又克服了傳統(tǒng)3D離子阱質(zhì)譜儀的缺點(diǎn)如低質(zhì)量截止點(diǎn)（1/3效應(yīng)）、“空間電荷效應(yīng)”、碰撞效率低、定量性能差等。它是一臺(tái)集優(yōu)異定性功能與定量功能于一體的質(zhì)譜儀，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)（組）研究、藥物開發(fā)、藥物代謝、有機(jī)化學(xué)、環(huán)境分析、毒物分析、食品檢驗(yàn)、商品檢測、衛(wèi)生防疫、煙草品質(zhì)改良等眾多領(lǐng)域。,線性離子阱：超大的離子容量：消除了傳統(tǒng)離子阱的“空間電荷

37、效應(yīng)”,多電荷增強(qiáng)掃描功能：有效消除單電荷離子的干擾，只檢測多電荷離子，更適合檢測微量的肽或蛋白質(zhì) MS3功能：MS3功能和串聯(lián)四極桿碰撞方式，只需進(jìn)行最少的實(shí)驗(yàn)卻提供最充分的結(jié)構(gòu)信息 動(dòng)態(tài)線性范圍寬保留3Q質(zhì)譜儀的優(yōu)異MRM定量性能，能夠檢測復(fù)雜基質(zhì)中的微量雜質(zhì),QTRAP實(shí)現(xiàn)MSn功能,以利血平為例: 第一步做母離子609的MS2譜，由于碰撞能量較高，既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片，且無1/3質(zhì)量CUT OFF現(xiàn)象，故從低質(zhì)量端到高質(zhì)量端產(chǎn)生碎片很多。 每個(gè)碎片均可做MS/MS/MS，從中確證下一級(jí)的碎片歸屬，進(jìn)而推斷分子結(jié)構(gòu)。 例如M/Z236和M/Z195是由M/Z448產(chǎn)生， M/

38、Z365和M/Z174是由M/Z397產(chǎn)生。 M/Z365,M/Z236和M/Z195還可繼續(xù)打碎。,RESERPINE-MS/MS,RESERPINE-MS/MS/MS（448）,RESERPINE-MS/MS/MS（397）,RESERPINE-MS/MS/MS（365）,RESERPINE-MS/MS/MS（195）,LC-MS技術(shù)的應(yīng)用,以大氣壓電離為接口的LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用,具體應(yīng)用領(lǐng)域,醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析 生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖 環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品

39、/水分析 臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。?、血紅蛋白變異、膽酸 食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物 法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測 獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體 合成化學(xué)：有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物 有機(jī)化學(xué)：表面活性劑、染料,藥物代謝研究,藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)上的最新重大進(jìn)展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/mlpg/ml），高選擇性（檢測特定的碎片離子）、高效率（每天可檢測幾百個(gè)生物樣品和對藥物結(jié)構(gòu)的廣泛適用性，對液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高

40、，可通過二級(jí)離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應(yīng)用于藥物代謝研究中一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和二期結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定、復(fù)雜生物樣品的自動(dòng)化分析以及代謝物結(jié)構(gòu)闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導(dǎo)地位，其測試的樣品量占總量的70%以上。,天然產(chǎn)物天然藥物的研究,目前中藥開發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開發(fā)研究。 采用現(xiàn)代多種儀器聯(lián)用新技術(shù)，特別是高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)，可對其十幾種乃至幾十種化學(xué)成分進(jìn)行指紋圖譜分離鑒定。再從指紋圖譜中選擇四、

41、五種指標(biāo)成分(有效成分或特征成分)進(jìn)行定量，可以確定出簡化的指紋圖譜和指標(biāo)成分，又是最合理的中藥復(fù)方質(zhì)量控制的方法，是研究中藥復(fù)雜體系，尤其是復(fù)方的有力工具。國內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。,臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析,歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標(biāo)志物的研究、檢測，具有專一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經(jīng)濟(jì)效益可觀等特點(diǎn)。目前可進(jìn)行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測、男女激素的監(jiān)測、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測、磷酸脂的檢測、血紅蛋白變異檢測

42、、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過鑒定DNA損傷程度測定）、藥物劑量監(jiān)測、藥物相互作用監(jiān)測、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測等。,殘留、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測定,專家指出，中國入世后，食品工業(yè)最大的問題就是安全壁壘，這將給中國的進(jìn)出口和國內(nèi)企業(yè)帶來極大的威脅。美國食品與藥品管理局 (FDA)、歐盟、日本、韓國等主要貿(mào)易國和地區(qū)公布了在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標(biāo)準(zhǔn)。這就要求中國加強(qiáng)農(nóng)、畜、水產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥等殘留的控制和檢測。 同樣隨著人類對生存環(huán)境的倍加關(guān)注，要求對環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學(xué)中毒物、濫用藥物等進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)控。而配以ESI、APCI和APPI離子化技術(shù)的LC/MS/MS以分析速度快、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用與殘留和毒物分析。目前已成功地進(jìn)行數(shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留和