第五講 分子克隆載體

1、,分子克隆載體,基因操作的基本步驟,載 體,單獨(dú)一個(gè)包括啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子的基因，或者組成基因的某個(gè)元件，一般是不易進(jìn)入受體細(xì)胞的，即使采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。 載體(vector): 能攜帶外源基因（或DNA片段）進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)的工具。,作為克隆載體的DNA分子具備的條件： 1 具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，能攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞； 2 能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)外源基因的增殖；,3 具有由單一限制酶識(shí)別位點(diǎn)組成的多克隆位點(diǎn)(MCS）； 4 克隆載體必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因； 5 克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)

2、任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。,多克隆位點(diǎn),ori,復(fù)制起始點(diǎn),遺傳標(biāo)記,Ampr,MCS,克隆載體,按功能分： 克隆載體 表達(dá)載體,質(zhì)?？寺≥d體 (plasmid cloning vector),質(zhì)粒(plasmid):是一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外裸露的dsDNA分子。 一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)DNA分子。 Plasmid chromosome,存在于細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻和綠藻的細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。,質(zhì)粒的存在形式： 一般以超螺旋共價(jià)閉環(huán)DNA分子(ccc-DNA)的形式存在。 也可以開環(huán)DNA分子(oc-DNA)和線性DNA分子(L-DNA)的形式存在。,質(zhì)粒DNA的大

3、小 質(zhì)粒 宿主 大?。╧b） pPbs 藍(lán)藻 1.5 CoLE1 大腸桿菌 6.4 PV21 三葉草根瘤菌 700 多數(shù)在10kb左右,質(zhì)粒的基本性質(zhì)： 1 復(fù)制,按照質(zhì)?？刂瓶截悢?shù)的程度，可以將質(zhì)粒分為: 1）嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringent plasmid) 拷貝數(shù)少，為15個(gè) 2 ）松散型質(zhì)粒(relaxed plasmid) 拷貝數(shù)多，可達(dá)10個(gè)拷貝以上,某種質(zhì)粒屬于嚴(yán)謹(jǐn)型或是松散型的，與宿主有一定的關(guān)系。 例子：質(zhì)粒ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松散型的，在奇異變形桿菌中是嚴(yán)謹(jǐn)型的。 一般來說，希望構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體是松散型的，所以在構(gòu)建的克隆載體中應(yīng)含有松散型的復(fù)制起始位點(diǎn)和調(diào)控

4、復(fù)制拷貝數(shù)的基因。,2 質(zhì)粒的不相容性(incompatibility): 兩種質(zhì)粒在同一宿主細(xì)胞中不能共存的現(xiàn)象。 親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒。 野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒屬于不親和性質(zhì)粒。 當(dāng)質(zhì)粒載體承載目的基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞時(shí)，考慮受體細(xì)胞內(nèi)原有的質(zhì)粒與作為克隆載體的質(zhì)粒是否屬于親和性質(zhì)粒。 作為受體細(xì)胞最好不含內(nèi)源質(zhì)粒。,3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性,接合型質(zhì)粒 (conjugative plasmid)： 轉(zhuǎn)移基因tra：指令宿主細(xì)胞產(chǎn)生菌毛、合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞的結(jié)合，使質(zhì)粒從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。 非接合型質(zhì)粒(non-conjugative plas

5、mid)： 順式作用元件： bom位點(diǎn) 移動(dòng)基因：mob基因 (分子質(zhì)量小、拷貝數(shù)多、被動(dòng)遷移),構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則,1 選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒 必備元件： A 復(fù)制起始點(diǎn) B 選擇標(biāo)記基因 C 克隆位點(diǎn) D 啟動(dòng)子 E 終止子 等等.,構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則,2 正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體克隆元件 一般用限制酶切割出發(fā)質(zhì)粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段。 為了獲得含某種元件的DNA片段，選用的切割位點(diǎn)既要保證元件完整無缺，又要使DNA片段愈小愈好，盡可能不含或少含不必要的序列，使構(gòu)建的載體盡可能小。,構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則,組裝合適的選擇標(biāo)記基因 構(gòu)建供轉(zhuǎn)化大腸桿菌用的質(zhì)粒載體，可組裝藍(lán)

6、/白顏色進(jìn)行選擇的(B-半乳糖苷酶基因)lacz基因。 但構(gòu)建供轉(zhuǎn)化藍(lán)藻用的質(zhì)粒載體不能用這個(gè)基因。因?yàn)樗{(lán)藻含有大量的藻藍(lán)蛋白。,構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則,4 選用合適的啟動(dòng)子 如果用真核生物基因的啟動(dòng)子作為原核生物表達(dá)克隆載體的啟動(dòng)子，其功效下降； 原核生物和病毒基因的啟動(dòng)子用作真核生物表達(dá)克隆載體的啟動(dòng)子，可保留其原來的功效。,構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則,5 在能達(dá)到預(yù)期目的的情況下，構(gòu)建過程要力求簡單。,構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略,1.構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)該是能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并作為質(zhì)?？寺≥d體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。 2.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片

7、段克隆的位點(diǎn)，并這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能多。,3.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。 4.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子應(yīng)盡可能小。 5.根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體中組裝各種元件，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。,質(zhì)粒的命名,用小寫字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個(gè)或三個(gè)大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱，再加上質(zhì)粒編號(hào)。 如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322為編號(hào)。,選擇標(biāo)記基因：(用于鑒別目的DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來） (1)氨

8、芐青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr) (3)四環(huán)素抗性基因 （tcr tetr） (4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr) (5)新霉素抗性基因（neor）,pBR322的大小是4361bp的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。 含有24種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。 將質(zhì)粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和質(zhì)粒pSC101中含tetr基因的DNA片段同含ColE1復(fù)制起始點(diǎn)(來源于pMB1、松散型)的DNA片段重組，構(gòu)建成質(zhì)粒克隆載體pBR3

9、22。,pBR322,普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖,pBR322,如何篩選？ 利用Tetr基因內(nèi)部的BamHI位點(diǎn)來插入外源DNA片段，可以通過插入失活進(jìn)行篩選。 BamHI G/GATTC,經(jīng)重組DNA分子轉(zhuǎn)化處理的受體菌在不含標(biāo)記藥物tc的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則含或不含重組DNA分子的受體菌都能長出菌落。 然后取菌落的一部分接種在含tc 的瓊脂培養(yǎng)基上，不會(huì)長出菌落的原菌落才是真正在tcr基因區(qū)插入外源DNA片段的克隆子。 （為什么？）,pUC質(zhì)粒,pUC質(zhì)粒系列是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的； 包括pBR322的ampr基因； 缺乏控制拷貝數(shù)的rop基因。,pUC的主要優(yōu)點(diǎn)： （1）分子

10、量更小，僅為2686bp，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。 （2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZ，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 （3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。,pUC18,pUC19,含四個(gè)部分： （1）來自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ori）； （2）ampr ; （3）大腸桿菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列； （4）多克隆位點(diǎn)（MCS）,lacZ,Ori,Ampr,MCS,Blue White,ampr,ampr,Insert,Insert,No insert,Lac

11、 Z,Lac Z,噬菌體載體 （lambda phage vector）,把感染細(xì)菌的病毒稱為噬菌體。 病毒主要有DNA（或RNA）和外殼蛋白組成。通過感染，病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。,T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖,噬菌體的性質(zhì),1 噬菌體由DNA和外殼蛋白組成。 2 在噬菌體中DNA是線性的，全長48502bp，左右各有12個(gè)核苷酸組成的5凸出黏性末端，而且是互補(bǔ)的。 5GGGCGGCGACCTNN.NN3 3NN.CCCGCCGCTGGA5 把此末端稱為 COS位點(diǎn)(cohesive end site) 3 其有50個(gè)以上基因 4 有56種限制酶識(shí)別位點(diǎn) 5 生長途徑有溶源途徑和溶菌途徑。,溶菌途徑：

12、噬菌體感染宿主細(xì)胞后，其DNA不插入染色體DNA，經(jīng)過一段時(shí)間的潛伏期，就大量增殖新的病毒顆粒，使宿主細(xì)胞破裂，釋放的病毒顆粒又感染其他細(xì)胞。（左圖示）,溶源途徑：感染宿主細(xì)胞后，其DNA與宿主細(xì)胞染色體DNA整合，一起復(fù)制和傳代，無感染其他細(xì)胞的能力。（右圖示）,噬菌體的基因組分區(qū),左區(qū)：Nul基因J基因之間的基因 其產(chǎn)物用于噬菌體DNA的包裝和噬菌體顆粒的形成。,噬菌體的基因組分區(qū),中區(qū)：J基因右邊gam基因之間的基因 溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳重組所需要的基因。（外源DNA片段的插入）,噬菌體的基因組分區(qū),右區(qū)：gam基因右邊Rz基因之間的基因 主要用于噬菌體的復(fù)制和裂解宿主菌。,用噬

13、菌體作為克隆載體的依據(jù),1 它是一種溫和噬菌體。 2 能承載比較大的外源DNA片段。 野生型的頭部能包裝DNA分子大小75%105%的DNA片段，約36.451kb。 3 在DNA分子上有許多限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。,DNA的限制性核酸內(nèi)切酶譜（Kb）,噬菌體載體的構(gòu)建過程,1 去除非必須區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn)； 2 在DNA的非必須區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 cI基因：它的表達(dá)使噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)，基因產(chǎn)物活性受到影響會(huì)促進(jìn)噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。 如果外源DNA片段插入基因cI中，將高效地使hfl突變的E.coli進(jìn)入裂解生長狀態(tài)。,3 建立重組 DNA分子的體外包裝系統(tǒng) 在實(shí)驗(yàn)室重組的

14、DNA分子，必須經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒后才有效地感染受體細(xì)胞。 噬菌體突變株D-和E- 當(dāng)兩個(gè)突變株分別感染受體細(xì)胞時(shí)，兩者都可復(fù)制 DNA，但不能把復(fù)制合成的 DNA包裝成噬菌體顆粒。二者蛋白混合，能有效地包裝。,噬菌體的主要類型,1 插入型載體(insertion vector): 通過特定酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。外源DNA片段大小0 6 kb。 2 置換型載體(replacement vector): 允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體。外源DNA片段大小923kb。,插入型載體,主要用于cDNA克隆，允許插入的外源DNA片段大小為06kb?；騝I內(nèi)的E.co

15、RI 位點(diǎn)作為唯一位點(diǎn)，可以用于外源DNA的插入。,主要用于cDNA文庫、基因組文庫和表達(dá)融合蛋白。允許插入的外源DNA片段的大小為07.2kb?；騦ac5編碼區(qū)終止密碼子之前有一個(gè)E.coRI，可以用于外源DNA的插入。,置換型載體,在填充片段兩端有對稱分布的MCS，這兩個(gè)載體的差別是MCS位點(diǎn)的排列位置相反。,M13噬菌體載體,基因工程中常對單鏈DNA測序、制備探針或?qū)嵤┒c(diǎn)突變，應(yīng)用此載體就可以獲得單鏈DNA。,黏粒載體(cosmid vector),基本特征： 1 是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。 2 其組成有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)、抗性基因、cos位點(diǎn)、MCS。 3

16、大小為57kb 4 能克隆的外源DNA片段最大達(dá)40kb。,黏粒載體的特點(diǎn)： （1）具有噬菌體的特性（但因不含噬菌體的全部必需基因，因此不能通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒）； （2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb, 克隆極限可達(dá)40kb左右）； （4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。 廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫的構(gòu)建。,部分柯斯質(zhì)粒的基本特性,人工染色體載體 (artificial chromosome vector),人工染色體載體： 利用染色體的復(fù)制功能來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。 1 酵母人工染色體載體(YAC) 2

17、 細(xì)菌人工染色體載體(BAC),利用釀酒酵母染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體。 復(fù)制的必須元件： 1自主復(fù)制序列(autonomously replication sequences,ARS) 是一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)。 2 著絲粒（centromere ,CEN） 有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。 3 端粒重復(fù)序列（telomeric repeat , TEL） 用于保護(hù)線狀DNA不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降降，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。,酵母人工染色體載體(YAC),YAC 載體的選擇標(biāo)記： 營養(yǎng)缺陷型基因 如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因trp 1、 leu 2 和his3 尿嘧啶合成缺陷基因ura3 赭石突變抑制基因sup4,赭石突變抑制基因sup4,外源DNA片段的裝載導(dǎo)致抑制基因sup4插入失活，從而使重組菌形成紅色菌落。而載體自身連接轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成的菌落為白色。,YAC文庫裝載的DNA片段的大小一般為250400kb，有的可以達(dá)到1Mb以上，甚至達(dá)到2Mb。 主要用來構(gòu)建大片段DNA文庫