生物樣品超薄切片技術(shù)

1、生物樣品，通常的樣品調(diào)制技術(shù)，特殊樣品調(diào)制技術(shù)，第四章透射電子顯微鏡生物樣品的制造技術(shù)，第一節(jié)載體網(wǎng)和支撐膜第二節(jié)極薄切片的制作第三節(jié)負染色技術(shù)，第一節(jié)載體網(wǎng)和支撐膜，第一，載體網(wǎng)：用于承載樣品的(直徑3mm )網(wǎng)狀材料。 1 .載體網(wǎng)的類型和選擇：70%的透過率，2 .載體網(wǎng)的清洗：酸堿法和有機溶劑、蒸餾水等清洗干燥。x射線元素分析、常規(guī)極薄切片(200目以上)、細胞化學、二、樣品支撐膜、為增強樣品強度，在載流子網(wǎng)表面鋪上薄膜。 1 .對膜的要求：其本身沒有結(jié)構(gòu)，薄透明，有充分的機械強度，電子束容易通過，與能承受電子束撞擊的樣品不發(fā)生化學反應(yīng)。 厚度1015nm，2 .常用支撐膜及其制造，福

2、莫瓦膜(Formvar):化學名稱：聚乙烯縮甲醛.特征：機械強度高，制作簡單.制作： 0.20.5%的氯仿溶液，玻璃片開封，水面剝離法。 操作方法，1 .福爾摩巴支撐薄膜的制作方法，2 .火棉凝膠膜用平盤水面展開法：在平盤中加入蒸餾水，滴下13%的火棉凝膠膜液，等待溶劑揮發(fā)后，在薄膜上放置干凈的銅網(wǎng)，撈濾紙。 3 .碳膜的制作：通過真空噴涂法的膜。 第二節(jié)極薄切片的制作、極薄切片：厚度小于100 (5070 )納米的切片。 要求：厚度均勻，厚度符合標準的無皺紋刃痕、顫抖、無沉淀細胞結(jié)構(gòu)保存良好，具有良好的電子對比度，具有一定的機械強度。 制作流程：六大股，四十多次操作，采訪固定脫水包埋切片染色

3、，鏡檢，極薄切片制作流程圖，一、采訪，包括從動植物機體和細胞和微生物培養(yǎng)物獲得必要的研究材料的操作流程。 1 .采訪原則要求：準、速、小、冷、輕的原則。 正確：根據(jù)研究目的確定采訪部位，取得典型部位。 迅速：材料分離后，請在1分鐘內(nèi)投入固定液。 體積?。汗潭ㄒ旱臐B透力受到限制，樣品體積為1mm或13mm長。 低溫：固定液和器材需要預(yù)冷(04 )，降低自溶解酶的活性。 防止損傷：器械銳利，切斷輕，防止壓迫，牽引損傷組織細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢，2 .采訪方法：動物材料的獲得：急性死刑或麻醉后，用12分鐘解剖所需材料，切成標準塊立即投入固定液，在低溫(04)下保存的特殊難取的材

4、料在insitu固定或灌流固定后，再采訪固定液投入植物材料的取得：葉切13長度的根，莖切標準塊，表面有毛刺的材料經(jīng)酶處理軟化，表面有蠟的葉去蠟，用蒸餾水清洗后采訪固定。 懸浮樣品的取得：加入適量的固定液懸浮固定后，用低速離心收集團塊進行固定。 保持低溫，野外采訪：拿著冰壺保存固定液和材料，確保動物材料現(xiàn)場固定植物材料可以保濕帶回實驗室后進行采訪固定。采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢，二、用固定、化學或物理的方法迅速殺死細胞的過程，1 .固定的目的：在分子水平上忠實地保存組織細胞的生活狀態(tài)的細節(jié)，盡量減少細胞死后的變化。 2 .固定類型：3 .固定液的作用：快速均勻地滲透到細胞內(nèi)部，使各種細胞成分穩(wěn)

5、定，破壞細胞的酶系，阻止細胞自溶解，通過化學作用建立分子交聯(lián)，提供形成細胞骨架的一定電子對比度。極低溫急速冷凍固定法，使用化學試劑快速殺死細胞，取材固定脫水切片染色鏡檢查，12.0%，4 .常用固定劑及其特征，甲醛類：甲醛，戊二醛，聚甲醛和丙烯醛，甲醛：滲透力無法保存核酸、核蛋白，保存在微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞膜系統(tǒng)中較好的脂質(zhì)，無電子染色作用。 調(diào)制方法：在2.05.0%中配合常用0.1M的磷酸緩沖液(pH6.87.2 )。 選擇：單細胞微生物動物組織植物組織厚壁組織，5.0%，鋨酸(OsO4)是唯一能保存脂肪的固定劑，具有電子染色作用。 不能固定脂蛋白和核蛋白，不能保存核酸和糖類。 采訪固定脫水

6、包埋切片染色鏡檢查，5 .固定方法：(1)單固定法：用于容易滲透的材料和酶的細胞化學，(2)雙固定法：用于戊二醛鋨酸雙重固定，(3)原位固定法：用于解剖困難、對缺氧敏感的組織器官(4)灌流固定：通過血液循環(huán)的途徑，將固定液注入相應(yīng)的部位，等組織適度硬化后再進行解剖采訪，通常進行固定。戊二醛、采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢查，直接影響被固定細胞本來的特定形態(tài)，6 .影響固定效果的因素，(1)固定液的堿度：固定液的堿度必須與固定材料的堿度大致一致。 例如，大多數(shù)動物的pH值平均為7.4，所以常用PH7.27.4的植物的pH值為6.87.1，因此常用PH7.07.2的原生動物和胚胎的pH值為8.08.

7、5、胃粘膜pH值為8.5的效果最高，(2)固定液的滲透壓：固定液和固定電解質(zhì)：鉀堿石灰玻璃(0.5% CaCl )是模仿防膨脹的非電解質(zhì)：蔗糖、葡萄糖膜系穩(wěn)定劑、采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢查，(3)緩沖液類型、磷酸緩沖液：細胞外液成分調(diào)制而成，無毒富含生理功能。 適合配合各種固定液和材料的沖洗液。 二鉀腎酸鹽緩沖液，有毒、穩(wěn)定性好。 適合細胞化學和保存脂肪的樣品處理、鈣離子定位研究，不可長期保存，取材固定脫水包埋切片染色鏡檢查： (4)根據(jù)固定時間、溫度和樣品塊的大小、時間：材料，單細胞和動物材料短，植物材料和厚壁組織長。 一到十二個小時。 溫度：低溫下抑制酶活性，通常在04的條件下固定。

8、樣品塊大小：受固定液滲透能力的影響，小塊材料容易被良好地固定。采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢，7 .注意事項，(1)控制固定溫度04抑制酶的活性，減少細胞自溶。 (2)把握固定時間：根據(jù)材料的種類和特征，后固定時間不要太長。 不那樣的話容易變成碎片。 (3)充分漂洗：去除殘留固定液。 (4)特殊材料的特殊處理：植物和較松的材料：吸入后沉入固定液的厚壁組織：采用低壓容器或振動方式促進滲透的表面有蠟質(zhì)材料：要脫蠟后再固定。 采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢查，三、脫水、脫水是指代替組織細胞中的游離水而使用適當?shù)挠袡C溶劑。 1 .必要性：水分的存在影響非水溶性包埋劑的滲透，進而影響切片的完整性，2 .常用

9、脫水劑：醇類(乙醇)和丙酮，3 .脫水方法：梯度系列脫水法。 30%50% 70% 80% 90 %95% 100%2次，4 .注意事項：脫水中斷只有70%，高濃度脫水劑容易使組織變脆，成分提?。?最終脫水劑為了保證脫水完全，首先必須用吸水劑處理的高濃度脫水操作，必須盡快防止樣品內(nèi)進入空氣或吸水。、采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢，四、滲透和包埋：用包埋劑逐漸置換樣品中的脫水劑，用包埋劑填充細胞內(nèi)外的所有空隙，聚合后，形成適合機械切斷的固體包埋塊。 1、包埋劑：理想包埋劑的特點：粘稠度低，易滲透的聚合均勻，抗體積收縮的電子束沖擊，高溫不變形，不升華本身沒有結(jié)構(gòu)，具有良好的切割性能，切片容易染色。

10、常用的包埋劑：非水溶性(Epon812 )和水溶性包埋劑。包埋劑Epon812或618硬化劑DDSA (十二烷基琥珀酸酐) MNA (六甲酸酐)增塑劑DBP (鄰苯二甲酸二丁酯)催化劑DMP-30用于618，一邊脫水一邊包埋，采訪固定脫水包埋切片鏡檢，2 .滲透，4 .滲透和包埋劑：轉(zhuǎn)移劑的比例根據(jù)1 :31 :13:1純包埋劑、滲透時間：材料而不同，3 .包埋、通常包埋：用牙簽將材料選擇為模具，注入包埋劑，做標記，定向包埋：樣品進入淺槽中，定向性、注射劑、標簽4 .聚合，37 (12h)45(12h)60(24h )，采訪固定脫水包埋染色鏡檢查，5，極薄切片，制刀修塊切片展片撈片，1 .切片

11、刃：金剛石刃，制作玻璃刃：2 .修塊：樣品要點：上下必須平行，形狀：前端面為梯形錐體(金字塔形)，取材固定脫水包埋切片染色鏡檢查，3 .切片，安裝刀，水：特別注意刃的高度和傾斜角，液面的高度，切片，撈片：切片帶用睫毛筆收集切片厚度的判斷：根據(jù)切片表面的反射光和切片下面的反射光的干涉色，厚度不同的切片呈現(xiàn)不同的顏色。 取材固定脫水包埋切片染色鏡檢，六、染色，1 .染色原理：結(jié)合或吸附重金屬鹽類和樣品中的某些成分，達到增加電子散射量提高對比度的目的. 電子染色，2 .電子染色劑：特異性，常用染色劑可以提高鈾和鉛鹽、乙酸鈾：核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織的對比度，膜系染色不良。 調(diào)制：13%的50%或70%

12、的乙醇溶液，遮光保存。 鉛鹽：對膜系、糖元、核蛋白、脂質(zhì)有很好的染色作用。 常用硝酸鉛和檸檬酸鈉水溶液配合檸檬酸鉛。 容易產(chǎn)生沉淀污染樣品。 調(diào)制：硝酸鉛1.33g檸檬酸鈉1.76g雙蒸餾水30ml，pH 1112，ph 4.2，30 min，用力搖動乳狀懸濁液，加入8ml 1N的NaOH，溶液變透明后向50ml中加入水，采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢1航空航空航空航空653，(2)雙重染色：鈾-鉛染色法，(3)塊染色：鉛-鈾-鉛染色能提高對比度，鈾染色2030分鐘，鉛染色1530分鐘，水洗303次，材料固定后，脫水前，整體50%航空、采訪固定脫水包埋切片染色鏡檢查，4 .示蹤染色，免疫電子顯微

13、鏡技術(shù)和(酶)細胞化學技術(shù)，采訪固定脫水切片染色鏡檢查，(1)概念：以各種大小的離子、分子等粒子為示蹤劑顯示細胞間的連接部位和方式，研究細胞的透過屏障(2)常用示蹤：硝酸鑭(2nm )、遼紅(0.76nm )、無機膠體金、草酸鈣及酶類、鐵蛋白等。 (3)染色方法：通常在所有處理液中加入示蹤劑。、硝酸鑭標記的蔥根尖細胞鑭粒子沉積在細胞間隙，利用電子顯微鏡的高分辨率和擴增能力，在超微結(jié)構(gòu)和分子水平上研究細胞的形態(tài)和功能，利用免疫抗體反應(yīng)的特異性和組織化學形態(tài)的可見性。 可以進行細胞內(nèi)抗體抗原的定性、定位研究。 例如，免疫鐵蛋白、酶(辛辣過氧化酶)、膠體金對鐵蛋白抗體、酶標記抗體、膠體金標記抗體的定

14、位、電鏡細胞化學技術(shù)：在盡可能保存細胞超微結(jié)構(gòu)的同時，在insitu用電子顯微鏡顯示生化反應(yīng)，結(jié)合結(jié)構(gòu)和功能的研究。 如酶在細胞內(nèi)的定位核酸(DNA，RNA )脂肪、碳水化合物的定位各種無機離子(鈣離子)定位等膠體金標記的葉片、極薄切片制作總結(jié)，一、制作過程應(yīng)掌握“六要一防”，采訪要正確固定。 適時漂洗要充分脫水必須完全染色切片防止污染，二、不同材料制作特征：動物組織：取材迅速、固定及時的植物材料：調(diào)節(jié)處理時間、完全確保滲透的游離細胞：注意收集樣品不丟失花粉、花粉、藻類：事前包埋收集、 三.處理時間，正確的防止損傷，24h，3次/15min，12h，8次/15min，34h，2次/15min，

15、3次/48h，鈾染： 1530min，500700，微黃色、黑色或1 .負染色：即利用陰性染色電子密度高、電子顯微鏡下不顯示結(jié)構(gòu)的重金屬鹽類在樣品周圍的沉積，增強樣品周圍的電子密度，突出樣品的形態(tài)和大小。 2 .原理：電子束通過高原子序數(shù)的物質(zhì)時，其電子和原子核碰撞的概率很高，會產(chǎn)生散射，容易形成負對比度。 任何物體都被密度為其自身2倍以上的物質(zhì)包圍，或者被浸漬的情況下，用電子顯微鏡增強對比度，形成負對比度。 二.負染色樣品的制備，具有一定濃度和純度的懸濁液，(一)直接取樣法：用于雜質(zhì)少、具有一定濃度的樣品，一.生長在固體培養(yǎng)基上的微生物：用接種環(huán)將二蒸餾水懸濁液刮掉，就可以滴下或附著樣品。

16、2 .放線菌孢子：二蒸餾水從菌體洗去懸濁液就能滴下來。 3、皮膚皰疹(水痘等)用毛細管穿刺取樣，直接滴下膜。 4 .植物染病體：切斷后，蒸餾水漂浮一段時間就會附上樣品。 必須保持生物植物，沖破表皮滴下蒸餾水，病毒游離的話就會附著樣品。 負染色樣品制備，(二)樣品精制法：用于雜質(zhì)大的材料，1 .離心精制法：用于血清、糞便、尿樣、痰液、生組織、植物研磨粉碎懸濁液，低速離心： 25003000rpm，10min，丟棄沉淀物(細胞碎片)高速離心： 15000 2 .透析精制法：除去鹽類雜質(zhì)，浮游于水面的膜靜置透析甲醛蒸氣固定1520分鐘，靜置透析324小時，3 .瓊脂過濾精制法：瓊脂過濾20分鐘，蒸餾水浮游剝離網(wǎng)染色，(3)病毒樣品濃縮法，1 .紅細胞吸附法：多個粘液病毒和亞粘液病毒將病毒懸濁液和等