六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的多維度機(jī)制探究

六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的多維度機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義隨著工業(yè)化進(jìn)程的加速，重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康構(gòu)成了巨大威脅。六價(jià)鉻（hexavalentchromium，Cr(Ⅵ)）作為一種重要的環(huán)境重金屬污染物，其污染現(xiàn)狀和危害備受關(guān)注。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）及美國(guó)政府工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家協(xié)會(huì)（ACGIH）早已確認(rèn)六價(jià)鉻化合物具有致癌性。除致癌性外，六價(jià)鉻還具有肝腎毒性、生殖毒性、遺傳毒性等多種毒性。六價(jià)鉻主要來(lái)源于電鍍、染料生產(chǎn)、皮革加工等工業(yè)活動(dòng)，這些行業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量含六價(jià)鉻的廢水、廢氣和廢渣。未經(jīng)處理的含六價(jià)鉻污染物直接排放，會(huì)導(dǎo)致水源污染、土壤污染，進(jìn)而影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡。如在河南某水廠除六價(jià)鉻的項(xiàng)目中，進(jìn)水六價(jià)鉻含量為0.7-1.2mg/L，大大超出了《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的0.05mg/L限值。長(zhǎng)期攝入含六價(jià)鉻的水或暴露在含六價(jià)鉻的環(huán)境中，人體健康會(huì)受到嚴(yán)重影響。研究表明，六價(jià)鉻可對(duì)呼吸道系統(tǒng)產(chǎn)生損害，增加肺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，還可能導(dǎo)致皮膚炎癥、肝損害、貧血等多種健康問(wèn)題。接觸鉻化物男工的精子生成與精子形態(tài)也可能受到不良影響，血清FSH顯著上升。在眾多受六價(jià)鉻危害的組織和器官中，呼吸系統(tǒng)首當(dāng)其沖。人支氣管上皮細(xì)胞作為呼吸道的重要組成部分，直接暴露于外界環(huán)境中，極易受到六價(jià)鉻的侵害。當(dāng)六價(jià)鉻進(jìn)入人體呼吸道后，會(huì)與支氣管上皮細(xì)胞直接接觸，通過(guò)一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引發(fā)肺癌等嚴(yán)重疾病。肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，也給社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大壓力。因此，深入研究六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制，對(duì)于揭示肺癌的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)有效的預(yù)防和治療策略具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。從理論層面來(lái)看，該研究有助于我們深入了解六價(jià)鉻致癌的分子生物學(xué)過(guò)程，豐富和完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論體系；從現(xiàn)實(shí)應(yīng)用角度出發(fā)，明確其作用機(jī)制后，能夠?yàn)榉伟┑脑缙谠\斷、預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和思路，從而降低肺癌的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生活質(zhì)量和生存率。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀六價(jià)鉻毒性的研究在國(guó)內(nèi)外均有深厚積累。國(guó)外早在1890年便開(kāi)啟了對(duì)六價(jià)鉻毒性危害的研究，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）及美國(guó)政府工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家協(xié)會(huì)（ACGIH）已確認(rèn)其化合物具有致癌性。在六價(jià)鉻致DNA損傷機(jī)制研究方面，國(guó)外有研究指出，六價(jià)鉻可通過(guò)單電子氧化還原循環(huán)（CrⅥ-CrⅤ-CrⅣ-CrⅢ）造成DNA損傷，此過(guò)程中羥自由基（OH?）起主要作用，如用質(zhì)粒松弛法和電子自旋共振法（ESR）檢測(cè)由CrⅢ與H?O?相互作用引起的DNA損傷時(shí)，發(fā)現(xiàn)OH?起關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也在不斷深入，有學(xué)者通過(guò)對(duì)鉻電鍍工人的研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組工人尿鉻含量及紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的鉻水平均明顯高于對(duì)照人群，且用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到鉻作業(yè)工人尿彗星尾延長(zhǎng)，提示有DNA損傷。此外，在六價(jià)鉻的生殖毒性研究中，國(guó)外報(bào)道其對(duì)生殖系統(tǒng)有潛在不良影響，國(guó)內(nèi)研究人員通過(guò)對(duì)接觸鉻化合物的男性生殖系統(tǒng)損害進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)接觸較高濃度鉻化物的電鍍工精子畸形率顯著增高，接觸鉻化物男工血清FSH顯著上升。人支氣管上皮細(xì)胞的研究同樣成果頗豐。國(guó)外研究詳細(xì)闡述了其解剖結(jié)構(gòu)，指出支氣管上皮細(xì)胞由偽復(fù)層纖毛柱狀上皮組成，表層有纖毛，基底部有基底細(xì)胞，不同類(lèi)型細(xì)胞如纖毛柱狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基底細(xì)胞等各具獨(dú)特功能，且細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接、橋粒連接和縫隙連接等維持上皮層的完整性和功能。國(guó)內(nèi)研究也關(guān)注到支氣管上皮細(xì)胞的多種生理功能，包括抵御外界有害物質(zhì)和微生物、分泌粘液阻隔病原體、通過(guò)纖毛擺動(dòng)清除異物以及在免疫防御、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞修復(fù)中發(fā)揮重要作用等，還發(fā)現(xiàn)其分泌功能異常與多種呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在六價(jià)鉻與支氣管上皮細(xì)胞相互作用的研究方面，國(guó)外有研究利用Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的16HBE細(xì)胞為對(duì)象，通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析蛋白表達(dá)譜改變及差異蛋白SET的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程的蛋白發(fā)生改變，SET可能通過(guò)抑制H3K18ac、H3K27ac水平介導(dǎo)p53轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控模式在Cr(Ⅵ)致癌中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)六價(jià)鉻體外誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2B惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)機(jī)理進(jìn)行初步研究。然而，目前對(duì)于六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制尚未完全明確，在信號(hào)通路的交互作用、關(guān)鍵基因和蛋白的上下游調(diào)控關(guān)系等方面仍存在研究空白，有待進(jìn)一步深入探索。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入揭示六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，為肺癌的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容從以下幾個(gè)層面展開(kāi)：基因?qū)用妫豪酶咄繙y(cè)序技術(shù)（如RNA-seq），全面分析六價(jià)鉻處理前后人支氣管上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化。通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出差異表達(dá)基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，對(duì)關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，確保基因表達(dá)變化的準(zhǔn)確性。利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9），敲除或過(guò)表達(dá)關(guān)鍵基因，觀察細(xì)胞表型的改變，驗(yàn)證基因在六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用。蛋白層面：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（如iTRAQ、TMT等），研究六價(jià)鉻處理后人支氣管上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，鑒定差異表達(dá)蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證和定量分析。采用免疫熒光染色技術(shù)，觀察關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化，進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能。利用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)（如Co-IP、Pull-down等），研究關(guān)鍵蛋白與其他蛋白之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制。信號(hào)通路層面：基于基因和蛋白層面的研究結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出可能參與六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路，如MAPK、PI3K-Akt、Wnt等信號(hào)通路。利用信號(hào)通路抑制劑和激活劑，干預(yù)相關(guān)信號(hào)通路的活性，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的變化，明確信號(hào)通路在六價(jià)鉻致癌過(guò)程中的作用。通過(guò)檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白的磷酸化水平和表達(dá)變化，研究六價(jià)鉻對(duì)信號(hào)通路的激活或抑制機(jī)制。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性，深入探討信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線(xiàn)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人支氣管上皮細(xì)胞系（如Beas-2B細(xì)胞）作為研究對(duì)象，用不同濃度的六價(jià)鉻溶液（如0μM、1μM、5μM、10μM等）處理細(xì)胞，分別設(shè)置不同的處理時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h）。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力。分子生物學(xué)技術(shù)：提取六價(jià)鉻處理前后細(xì)胞的總RNA，利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序，分析基因表達(dá)譜的變化。提取細(xì)胞總蛋白，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（如iTRAQ、TMT等）進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，鑒定差異表達(dá)蛋白。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)基因的mRNA水平，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平。利用免疫熒光染色技術(shù)，觀察關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化。生物信息學(xué)分析：對(duì)RNA-seq和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括差異表達(dá)基因和蛋白的篩選、功能注釋、富集分析（GO富集分析、KEGG通路富集分析等），構(gòu)建基因和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，挖掘潛在的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路。信號(hào)通路研究：根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，選擇可能參與六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路，利用信號(hào)通路抑制劑（如U0126抑制MAPK通路、LY294002抑制PI3K-Akt通路等）和激活劑（如EGF激活MAPK通路、IGF-1激活PI3K-Akt通路等）處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。通過(guò)檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白的磷酸化水平和表達(dá)變化，研究六價(jià)鉻對(duì)信號(hào)通路的激活或抑制機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（可選）：選取健康的裸鼠，將六價(jià)鉻處理后的人支氣管上皮細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）和未處理的正常細(xì)胞（對(duì)照組）分別皮下注射到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量腫瘤體積和重量。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理切片分析，觀察腫瘤的形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。技術(shù)路線(xiàn)如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)、六價(jià)鉻處理、各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等）到數(shù)據(jù)處理與分析、結(jié)果驗(yàn)證，最終得出結(jié)論的整個(gè)流程]通過(guò)上述研究方法和技術(shù)路線(xiàn)，全面深入地探究六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，為肺癌的防治提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和新的靶點(diǎn)。二、六價(jià)鉻與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)2.1六價(jià)鉻的特性與來(lái)源六價(jià)鉻（Cr(Ⅵ)）是鉻元素的一種高價(jià)態(tài)氧化態(tài)，在環(huán)境和生物體中具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和行為。從化學(xué)性質(zhì)來(lái)看，六價(jià)鉻通常以含氧酸根的形式存在，在酸性溶液中主要為橙色的重鉻酸根離子（Cr?O?2?），在堿性溶液中則主要是黃色的鉻酸根離子（CrO?2?）。這種存在形式的差異與溶液的酸堿度密切相關(guān)，其化學(xué)平衡可表示為：Cr?O?2?+H?O\rightleftharpoons2CrO?2?+2H?。六價(jià)鉻具有較強(qiáng)的氧化性，在酸性環(huán)境中，其氧化性尤為突出，這使得它能夠參與多種氧化還原反應(yīng)。例如，在酸性條件下，六價(jià)鉻可以將亞鐵離子（Fe2?）氧化為鐵離子（Fe3?），自身被還原為三價(jià)鉻（Cr(Ⅲ)），反應(yīng)方程式為：Cr?O?2?+6Fe2?+14H?=2Cr3?+6Fe3?+7H?O。常見(jiàn)的六價(jià)鉻化合物包括鉻酸酐（CrO?）、重鉻酸鈉（Na?Cr?O?）、重鉻酸鉀（K?Cr?O?）、鉻酸鉀（K?CrO?）等。鉻酸酐，又稱(chēng)三氧化鉻，為暗紅色或暗紫色斜方結(jié)晶，易潮解，熔點(diǎn)為196℃，在加熱時(shí)會(huì)分解產(chǎn)生氧氣和三氧化二鉻。它是一種強(qiáng)氧化劑，與有機(jī)物接觸摩擦能引起燃燒，可用于鍍鉻、制備鉻酸鹽、顏料等領(lǐng)域。重鉻酸鈉是一種橙紅色晶體，易溶于水，其水溶液呈酸性，具有強(qiáng)氧化性，常用于皮革鞣制、電鍍、印染等工業(yè)。重鉻酸鉀為橙紅色三斜晶體或針狀晶體，在水中的溶解度隨溫度升高而顯著增大，它也是一種重要的氧化劑，在實(shí)驗(yàn)室中常用于氧化還原滴定，在工業(yè)上用于制造鉻顏料、火柴、煙花等。鉻酸鉀是黃色晶體，溶于水，其水溶液呈堿性，在分析化學(xué)中常用于沉淀滴定法，如莫爾法測(cè)定氯離子時(shí)，鉻酸鉀作為指示劑。六價(jià)鉻的來(lái)源主要包括自然來(lái)源和人為來(lái)源。自然來(lái)源方面，地殼中的鉻礦石在風(fēng)化、侵蝕等自然作用下，會(huì)使其中的鉻元素釋放到環(huán)境中，部分可轉(zhuǎn)化為六價(jià)鉻。例如，某些含鉻的礦物在與空氣中的氧氣、水以及酸性物質(zhì)長(zhǎng)期作用后，其中的三價(jià)鉻可能被氧化為六價(jià)鉻。然而，自然來(lái)源產(chǎn)生的六價(jià)鉻在環(huán)境中的含量相對(duì)較低，且分布較為分散。人為來(lái)源是六價(jià)鉻在環(huán)境中大量存在的主要原因，主要來(lái)自于各種工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)。在電鍍行業(yè)，六價(jià)鉻常被用于金屬表面處理，以提高金屬的耐腐蝕性和裝飾性。在鍍鉻過(guò)程中，鍍液中通常含有六價(jià)鉻化合物，如鉻酸酐和硫酸的混合液，在電鍍過(guò)程中，部分六價(jià)鉻可能會(huì)隨著廢水、廢氣排放到環(huán)境中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，電鍍行業(yè)排放的含六價(jià)鉻廢水中，六價(jià)鉻濃度可高達(dá)數(shù)百毫克每升。在皮革鞣制行業(yè)，六價(jià)鉻化合物被用作鞣劑，可使皮革具有良好的柔韌性和耐用性。但在鞣制過(guò)程中，若操作不當(dāng)或處理不徹底，會(huì)導(dǎo)致大量含六價(jià)鉻的廢水和廢渣產(chǎn)生。有研究表明，皮革鞣制過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣中六價(jià)鉻含量可達(dá)數(shù)千毫克每千克。染料生產(chǎn)行業(yè)也是六價(jià)鉻的重要排放源，部分鉻系染料在生產(chǎn)過(guò)程中需要使用六價(jià)鉻化合物作為原料或催化劑，生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生含六價(jià)鉻的廢水和廢氣。此外，在鋼鐵生產(chǎn)、金屬加工、木材防腐等行業(yè)，也會(huì)使用六價(jià)鉻化合物，從而導(dǎo)致六價(jià)鉻進(jìn)入環(huán)境。六價(jià)鉻對(duì)環(huán)境和人體的污染途徑多種多樣。在環(huán)境中，含六價(jià)鉻的廢水排放到水體后，會(huì)使水體中的六價(jià)鉻含量升高，影響水生生物的生存和繁殖。如當(dāng)水體中六價(jià)鉻濃度達(dá)到0.1mg/L時(shí)，就可能對(duì)魚(yú)類(lèi)等水生生物產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)緩慢、繁殖能力下降甚至死亡。含六價(jià)鉻的廢氣排放到大氣中，會(huì)隨著大氣環(huán)流擴(kuò)散，部分六價(jià)鉻會(huì)通過(guò)干濕沉降的方式進(jìn)入土壤和水體，造成土壤和水體的污染。在土壤中，六價(jià)鉻會(huì)被土壤顆粒吸附，影響土壤的理化性質(zhì)和微生物活性，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)。當(dāng)土壤中六價(jià)鉻含量過(guò)高時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻、葉片發(fā)黃、枯萎等癥狀，甚至死亡。對(duì)于人體而言，主要通過(guò)呼吸道、消化道和皮膚接觸三種途徑暴露于六價(jià)鉻。在工業(yè)生產(chǎn)場(chǎng)所，工人吸入含六價(jià)鉻的粉塵、煙霧或氣溶膠，六價(jià)鉻會(huì)直接進(jìn)入呼吸道，對(duì)呼吸道黏膜產(chǎn)生刺激和損傷，長(zhǎng)期暴露可導(dǎo)致呼吸道炎癥、肺癌等疾病。有研究對(duì)鉻電鍍工人進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其肺癌發(fā)病率明顯高于普通人群。當(dāng)人們飲用被六價(jià)鉻污染的水或食用受六價(jià)鉻污染的食物時(shí)，六價(jià)鉻會(huì)通過(guò)消化道進(jìn)入人體。在消化道中，六價(jià)鉻可被吸收進(jìn)入血液，進(jìn)而分布到全身各個(gè)組織和器官，對(duì)人體的肝臟、腎臟、血液系統(tǒng)等造成損害。皮膚接觸含六價(jià)鉻的物質(zhì)，如工作中接觸含六價(jià)鉻的溶液或粉塵，六價(jià)鉻可通過(guò)皮膚吸收進(jìn)入人體，引起皮膚過(guò)敏、皮炎、潰瘍等癥狀。2.2人支氣管上皮細(xì)胞概述人支氣管上皮細(xì)胞（HumanBronchialEpithelialCells）是覆蓋在支氣管內(nèi)表面的一層細(xì)胞，在呼吸系統(tǒng)中扮演著極為重要的角色，具有多種關(guān)鍵的生理功能。從解剖結(jié)構(gòu)來(lái)看，支氣管上皮由偽復(fù)層纖毛柱狀上皮組成，表層有纖毛，基底部有基底細(xì)胞。這種結(jié)構(gòu)使得支氣管上皮能夠有效地執(zhí)行其保護(hù)、分泌、免疫等功能。在生理功能方面，人支氣管上皮細(xì)胞首先具有強(qiáng)大的保護(hù)功能，作為呼吸道的第一道防線(xiàn)，能夠抵御外界有害物質(zhì)和微生物的入侵。其表面的纖毛具有協(xié)調(diào)擺動(dòng)的功能，可幫助排出呼吸道中的異物和分泌物。這些纖毛以特定的頻率和方向擺動(dòng)，將粘液和捕獲的物質(zhì)向咽喉方向移動(dòng)，從而清除支氣管內(nèi)的灰塵、煙霧和微生物等異物，保證呼吸道的清潔。杯狀細(xì)胞分泌的粘液則形成一層保護(hù)性的粘液層，覆蓋于支氣管上皮表面，不僅可以阻隔病原體進(jìn)入呼吸道，還具有一定的殺菌作用，為呼吸道提供了物理和化學(xué)雙重保護(hù)。人支氣管上皮細(xì)胞還具有重要的免疫功能，作為免疫系統(tǒng)的一部分，參與多種免疫反應(yīng)。它能夠識(shí)別并俘獲病原體，將抗原肽呈遞給免疫細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。同時(shí)，細(xì)胞因子釋放功能也很關(guān)鍵，當(dāng)受到病原體刺激時(shí)，會(huì)釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，招募免疫細(xì)胞并協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。此外，人支氣管上皮細(xì)胞還能產(chǎn)生抗體，與病原體結(jié)合并摧毀它們，參與抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及識(shí)別并殺死受感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮自然殺傷細(xì)胞活性。在六價(jià)鉻毒性研究中，人支氣管上皮細(xì)胞作為理想的模型具有諸多優(yōu)勢(shì)。由于其直接暴露于外界環(huán)境，當(dāng)六價(jià)鉻通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體時(shí)，會(huì)首先與支氣管上皮細(xì)胞接觸，因此該細(xì)胞能夠真實(shí)地反映六價(jià)鉻對(duì)呼吸道的早期損傷作用。從細(xì)胞生物學(xué)特性來(lái)看，人支氣管上皮細(xì)胞易于獲取和培養(yǎng)，在體外培養(yǎng)條件下能夠保持其生物學(xué)特性，便于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作和研究。例如，通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可在含有特定生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞，為研究六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞的毒性作用提供了充足的細(xì)胞來(lái)源。而且，其基因和蛋白表達(dá)譜相對(duì)明確，便于研究六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)和信號(hào)通路的影響，能夠深入探究六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。2.3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)理論細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化是指正常細(xì)胞在受到各種致癌因素的作用下，逐漸失去正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，獲得無(wú)限增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，以及形態(tài)和功能發(fā)生改變的過(guò)程。這一過(guò)程涉及多個(gè)層面的變化，是一個(gè)復(fù)雜且逐步發(fā)展的生物學(xué)過(guò)程，與多種基因和信號(hào)通路的異常密切相關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控是細(xì)胞正常生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵機(jī)制，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著核心作用。細(xì)胞周期可分為G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。在細(xì)胞周期的進(jìn)程中，存在多個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)，如G1/S期限制點(diǎn)和G2/M期檢查點(diǎn)，這些調(diào)控點(diǎn)確保細(xì)胞周期的有序進(jìn)行。細(xì)胞周期的調(diào)控主要依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（CKI）之間的相互作用。Cyclin在細(xì)胞周期的不同階段呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)和降解，其濃度的周期性變化與細(xì)胞周期的進(jìn)程緊密相關(guān)。例如，CyclinD在G1期表達(dá)增加，與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，進(jìn)而使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F激活一系列與DNA合成相關(guān)的基因表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。CDK是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性依賴(lài)于與Cyclin的結(jié)合。不同的Cyclin-CDK復(fù)合物在細(xì)胞周期的特定階段發(fā)揮作用，如CyclinE-CDK2復(fù)合物在G1/S期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，而CyclinA-CDK2復(fù)合物則主要參與S期和G2期的調(diào)控，CyclinB-CDK1復(fù)合物在G2/M期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。CKI能夠抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，從而調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，CKI可分為Ink4家族和Cip/Kip家族。Ink4家族成員（如p16INK4a、p15INK4b等）主要抑制CDK4/6的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期；Cip/Kip家族成員（如p21Cip1、p27Kip1等）則可抑制多種Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，對(duì)細(xì)胞周期的多個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期受到嚴(yán)格的調(diào)控，各調(diào)控因子之間相互協(xié)調(diào)，維持細(xì)胞周期的平衡和穩(wěn)定。然而，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制常常發(fā)生異常。例如，某些癌基因的激活或抑癌基因的失活，可導(dǎo)致Cyclin的過(guò)度表達(dá)或CKI的表達(dá)下調(diào)，使Cyclin-CDK復(fù)合物的活性異常升高，從而促使細(xì)胞繞過(guò)正常的細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)，持續(xù)進(jìn)行增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤細(xì)胞中，CyclinD1基因發(fā)生擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，使得CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物的活性增強(qiáng)，推動(dòng)細(xì)胞異常增殖。p16INK4a基因在多種腫瘤中常發(fā)生缺失或突變，導(dǎo)致p16INK4a蛋白表達(dá)減少，無(wú)法有效抑制CDK4/6的活性，進(jìn)而破壞細(xì)胞周期的正常調(diào)控。癌基因與抑癌基因的平衡失調(diào)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要分子機(jī)制之一。癌基因是一類(lèi)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的基因，其正常形式被稱(chēng)為原癌基因。原癌基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能，但當(dāng)原癌基因發(fā)生突變、擴(kuò)增或易位等異常改變時(shí)，會(huì)被激活成為癌基因，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，從而使細(xì)胞獲得惡性增殖的能力。常見(jiàn)的癌基因包括Ras、Myc、Src等。Ras基因編碼的Ras蛋白是一種小GTP酶，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，Ras蛋白與GDP結(jié)合處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，Ras蛋白與GTP結(jié)合而激活，激活后的Ras蛋白可通過(guò)一系列下游信號(hào)通路，如Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和遷移。當(dāng)Ras基因發(fā)生突變時(shí)，Ras蛋白持續(xù)處于激活狀態(tài)，不斷激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖和惡性轉(zhuǎn)化。抑癌基因則是一類(lèi)能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起到負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)抑癌基因發(fā)生突變、缺失或表達(dá)下調(diào)時(shí)，其抑制細(xì)胞增殖的功能喪失，無(wú)法有效對(duì)抗癌基因的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。常見(jiàn)的抑癌基因有p53、Rb、PTEN等。p53基因是一種重要的抑癌基因，編碼的p53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白被激活，通過(guò)上調(diào)p21Cip1等基因的表達(dá)，抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，為DNA損傷修復(fù)提供時(shí)間。如果DNA損傷無(wú)法修復(fù)，p53蛋白則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以清除受損細(xì)胞，防止細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。然而，在大多數(shù)腫瘤中，p53基因常發(fā)生突變，導(dǎo)致p53蛋白功能喪失，無(wú)法發(fā)揮其抑癌作用，使得細(xì)胞能夠逃避正常的生長(zhǎng)調(diào)控，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的凋亡調(diào)控異常也與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，在維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)量平衡、清除受損或異常細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及多個(gè)信號(hào)通路和基因的參與，主要包括內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑。內(nèi)源性凋亡途徑主要由線(xiàn)粒體介導(dǎo)，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，線(xiàn)粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。外源性凋亡途徑則是由死亡受體介導(dǎo)，如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，招募接頭蛋白FADD和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，進(jìn)而激活下游的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，凋亡調(diào)控機(jī)制常常發(fā)生異常，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，使得受損或異常細(xì)胞得以存活和增殖。例如，某些癌基因的表達(dá)產(chǎn)物可抑制細(xì)胞凋亡，如Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白，能夠抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷內(nèi)源性凋亡途徑。一些抑癌基因的失活也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常，如p53基因的突變或缺失，使細(xì)胞無(wú)法正常啟動(dòng)凋亡程序，增加了細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。三、六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人支氣管上皮細(xì)胞系Beas-2B，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞系具有良好的生物學(xué)特性，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定傳代，且保持其上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能特征，是研究六價(jià)鉻對(duì)支氣管上皮細(xì)胞影響的常用細(xì)胞模型。六價(jià)鉻化合物：重鉻酸鉀（K_2Cr_2O_7），純度≥99.5%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。重鉻酸鉀是一種常見(jiàn)的六價(jià)鉻化合物，在水中易溶解，能夠穩(wěn)定地提供六價(jià)鉻離子，用于細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺、酚紅），購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿(mǎn)足Beas-2B細(xì)胞的生長(zhǎng)需求；胎牛血清（FBS），購(gòu)自BiologicalIndustries公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×），購(gòu)自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，購(gòu)自HyClone公司，用于細(xì)胞的傳代和消化。實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)條件；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），提供無(wú)菌的操作環(huán)境，減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Tek），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems），用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平；蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)設(shè)備，包括電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)等，用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。3.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)六價(jià)鉻染毒劑量和時(shí)間設(shè)置：參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置六價(jià)鉻的染毒劑量為0μM（對(duì)照組）、1μM、5μM、10μM。染毒時(shí)間分別為24h、48h、72h。不同的染毒劑量和時(shí)間組合旨在全面探究六價(jià)鉻對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的毒性作用及惡性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)效應(yīng)，觀察細(xì)胞在不同濃度和時(shí)間的六價(jià)鉻暴露下的生物學(xué)行為變化。細(xì)胞分組：將Beas-2B細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組（不做任何處理）、低劑量染毒組（1μM六價(jià)鉻處理）、中劑量染毒組（5μM六價(jià)鉻處理）、高劑量染毒組（10μM六價(jià)鉻處理）。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對(duì)照設(shè)置：對(duì)照組除不添加六價(jià)鉻外，其他培養(yǎng)條件與染毒組相同，用于對(duì)比分析六價(jià)鉻處理對(duì)細(xì)胞的影響。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照孔，只含有培養(yǎng)基，用于校正酶標(biāo)儀等儀器的讀數(shù)，排除非細(xì)胞因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。重復(fù)實(shí)驗(yàn)安排：為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每次實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行，包括細(xì)胞培養(yǎng)、六價(jià)鉻染毒、各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)等步驟，對(duì)3次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得更具說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。3.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞形態(tài)觀察：在倒置顯微鏡下，每天觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。正常的Beas-2B細(xì)胞呈多邊形或梭形，形態(tài)規(guī)則，貼壁生長(zhǎng)良好。六價(jià)鉻處理后，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)形態(tài)改變，如細(xì)胞變圓、皺縮、脫落，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則等，這些形態(tài)變化可能是細(xì)胞受到損傷或發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的早期表現(xiàn)。細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。在96孔板中接種密度為5×10^3個(gè)/孔的Beas-2B細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行六價(jià)鉻染毒處理。在染毒后的0h、24h、48h、72h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，OD值越高，表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。通過(guò)比較不同組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和OD值，評(píng)估六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞周期分析：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。將染毒后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4℃過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光染色30min。最后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期分布。細(xì)胞周期分為G1期、S期和G2/M期，通過(guò)分析不同時(shí)期細(xì)胞的比例，了解六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞周期的影響。例如，若G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，可能表明細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制了細(xì)胞的增殖。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)中，在上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（5×10^4個(gè)/孔），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。侵襲實(shí)驗(yàn)中，在上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，然后加入細(xì)胞（1×10^5個(gè)/孔），下室同樣加入含10%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24-48h后，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，下室的細(xì)胞用甲醇固定，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞遷移和侵襲能力越強(qiáng)，下室的細(xì)胞數(shù)量越多，通過(guò)比較不同組下室細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響在倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組的人支氣管上皮細(xì)胞（Beas-2B）呈現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，細(xì)胞之間緊密相連，排列規(guī)則，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好，具有正常的細(xì)胞極性，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，位于細(xì)胞中央（圖3-1A）。當(dāng)用不同濃度的六價(jià)鉻處理細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化。在低劑量（1μM）六價(jià)鉻處理24h后，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)改變，細(xì)胞變得稍微扁平，細(xì)胞間隙略有增大，但整體形態(tài)仍相對(duì)接近正常細(xì)胞（圖3-1B）。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)至48h和72h，細(xì)胞形態(tài)改變更為明顯，細(xì)胞體積增大，形態(tài)變得不規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)偽足樣突起。在中劑量（5μM）六價(jià)鉻處理組，24h時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變較為明顯，細(xì)胞間隙進(jìn)一步增大，部分細(xì)胞變圓，失去了正常的多邊形形態(tài)，貼壁能力有所下降（圖3-1C）。48h后，細(xì)胞形態(tài)變化加劇，許多細(xì)胞呈現(xiàn)出拉長(zhǎng)的形態(tài)，細(xì)胞核形態(tài)也發(fā)生改變，出現(xiàn)核固縮、核碎裂等現(xiàn)象，表明細(xì)胞受到了嚴(yán)重的損傷。72h時(shí)，可見(jiàn)大量細(xì)胞脫落，漂浮在培養(yǎng)基中，存活的細(xì)胞形態(tài)也極不規(guī)則，呈現(xiàn)出明顯的惡性轉(zhuǎn)化特征。高劑量（10μM）六價(jià)鉻處理組，細(xì)胞形態(tài)變化最為迅速和顯著。處理24h后，大部分細(xì)胞已變圓，細(xì)胞間隙明顯增大，貼壁不牢，許多細(xì)胞開(kāi)始脫落（圖3-1D）。48h時(shí)，細(xì)胞大量死亡，存活的細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的惡性轉(zhuǎn)化形態(tài)，如細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)怪異，具有多個(gè)偽足，細(xì)胞核大且形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝集。72h時(shí)，幾乎看不到正常形態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞死亡率極高。[此處插入不同濃度六價(jià)鉻處理不同時(shí)間后人支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)變化的圖片，圖片清晰標(biāo)注對(duì)照組、1μM組、5μM組、10μM組，以及24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)，圖片分辨率高，能夠清晰展示細(xì)胞形態(tài)細(xì)節(jié)]細(xì)胞形態(tài)的改變與惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。正常細(xì)胞具有規(guī)則的形態(tài)和極性，這是其正常生理功能的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞受到六價(jià)鉻的作用后，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。細(xì)胞間隙增大、形態(tài)不規(guī)則、偽足形成等變化，是細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，這些變化使得細(xì)胞能夠突破細(xì)胞間的連接和基底膜的限制，從而具備向周?chē)M織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力，是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志之一。核形態(tài)的改變，如核固縮、核碎裂以及染色質(zhì)凝集等，反映了細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的損傷和細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂，進(jìn)一步推動(dòng)了細(xì)胞向惡性方向發(fā)展。因此，六價(jià)鉻誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)改變，是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的一個(gè)重要早期事件，為后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)行為的改變奠定了基礎(chǔ)。3.2.2細(xì)胞增殖能力變化通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同濃度六價(jià)鉻處理不同時(shí)間后人支氣管上皮細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果如圖3-2所示。在對(duì)照組中，細(xì)胞呈現(xiàn)出正常的增殖趨勢(shì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，在72h時(shí)達(dá)到較高的細(xì)胞密度，OD450值從0h的0.15±0.02逐漸增加到72h的0.85±0.05（P<0.01）。在低劑量（1μM）六價(jià)鉻處理組，細(xì)胞增殖能力在24h時(shí)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），OD450值為0.20±0.03。然而，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，48h時(shí)細(xì)胞增殖能力開(kāi)始受到抑制，OD450值為0.50±0.04，顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。72h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制更為明顯，OD450值為0.65±0.05，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。中劑量（5μM）六價(jià)鉻處理組，細(xì)胞增殖能力在24h時(shí)就受到顯著抑制，OD450值為0.10±0.02，明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。48h時(shí)，細(xì)胞增殖幾乎停滯，OD450值為0.12±0.02，72h時(shí)，OD450值略有上升，為0.15±0.03，但仍顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。高劑量（10μM）六價(jià)鉻處理組，細(xì)胞增殖能力受到嚴(yán)重抑制。24h時(shí)，OD450值為0.05±0.01，顯著低于對(duì)照組（P<0.01），表明細(xì)胞增殖受到強(qiáng)烈抑制。48h和72h時(shí)，細(xì)胞增殖幾乎完全停止，OD450值分別為0.06±0.01和0.07±0.01，與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。[此處插入細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的柱狀圖和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，柱狀圖展示不同濃度六價(jià)鉻處理不同時(shí)間點(diǎn)的OD450值，生長(zhǎng)曲線(xiàn)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，清晰展示對(duì)照組和各處理組細(xì)胞增殖隨時(shí)間的變化趨勢(shì)]上述結(jié)果表明，六價(jià)鉻對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞增殖能力的影響具有明顯的時(shí)間-劑量依賴(lài)關(guān)系。隨著六價(jià)鉻濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。在低濃度和短時(shí)間處理時(shí)，細(xì)胞可能通過(guò)自身的修復(fù)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)六價(jià)鉻的損傷，因此增殖抑制不明顯。但隨著損傷的積累，細(xì)胞的修復(fù)能力逐漸無(wú)法彌補(bǔ)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。高濃度的六價(jià)鉻則會(huì)迅速對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，直接抑制細(xì)胞的增殖相關(guān)信號(hào)通路和細(xì)胞周期進(jìn)程，使得細(xì)胞增殖幾乎完全停止。細(xì)胞增殖能力的改變是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要特征之一，六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，進(jìn)而促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化方向發(fā)展。3.2.3細(xì)胞周期異常采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度六價(jià)鉻處理后人支氣管上皮細(xì)胞的周期分布，結(jié)果如表3-1所示。對(duì)照組中，細(xì)胞周期分布正常，G1期細(xì)胞占比為55.2±2.1%，S期細(xì)胞占比為30.5±1.8%，G2/M期細(xì)胞占比為14.3±1.2%。在低劑量（1μM）六價(jià)鉻處理24h后，G1期細(xì)胞比例略有增加，為58.5±2.3%，S期細(xì)胞比例略有下降，為28.0±1.5%，G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化，為13.5±1.0%，與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。處理48h后，G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，達(dá)到62.0±2.5%，S期細(xì)胞比例下降至25.0±1.3%，G2/M期細(xì)胞比例下降至13.0±1.1%，G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01），表明細(xì)胞周期開(kāi)始出現(xiàn)阻滯在G1期的現(xiàn)象。處理72h后，G1期細(xì)胞比例持續(xù)增加，為65.0±2.8%，S期細(xì)胞比例降至22.0±1.2%，G2/M期細(xì)胞比例降至13.0±1.0%，G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。中劑量（5μM）六價(jià)鉻處理24h后，G1期細(xì)胞比例顯著增加，達(dá)到65.0±2.6%，S期細(xì)胞比例顯著下降，為20.0±1.0%，G2/M期細(xì)胞比例下降至15.0±1.3%，與對(duì)照組相比，G1期和S期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。處理48h后，G1期細(xì)胞比例高達(dá)70.0±2.9%，S期細(xì)胞比例降至18.0±1.1%，G2/M期細(xì)胞比例降至12.0±1.0%，G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。處理72h后，G1期細(xì)胞比例為72.0±3.0%，S期細(xì)胞比例為16.0±1.0%，G2/M期細(xì)胞比例為12.0±1.0%，G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。高劑量（10μM）六價(jià)鉻處理24h后，G1期細(xì)胞比例急劇增加，達(dá)到75.0±3.2%，S期細(xì)胞比例大幅下降，為10.0±0.8%，G2/M期細(xì)胞比例降至15.0±1.4%，與對(duì)照組相比，G1期和S期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。處理48h后，G1期細(xì)胞比例高達(dá)80.0±3.5%，S期細(xì)胞比例降至8.0±0.7%，G2/M期細(xì)胞比例降至12.0±1.0%，G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。處理72h后，G1期細(xì)胞比例為82.0±3.6%，S期細(xì)胞比例為7.0±0.6%，G2/M期細(xì)胞比例為11.0±1.0%，G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。[此處插入細(xì)胞周期分析的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖，以直方圖形式展示對(duì)照組和各處理組細(xì)胞在G1期、S期、G2/M期的比例分布，圖片清晰標(biāo)注各時(shí)期和處理組]進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)隨著六價(jià)鉻濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CyclinD1和CyclinE的表達(dá)水平逐漸降低，而p21Cip1和p27Kip1的表達(dá)水平逐漸升高。在對(duì)照組中，CyclinD1和CyclinE的蛋白表達(dá)水平較高，p21Cip1和p27Kip1的蛋白表達(dá)水平較低。低劑量六價(jià)鉻處理后，CyclinD1和CyclinE的表達(dá)開(kāi)始下降，p21Cip1和p27Kip1的表達(dá)開(kāi)始上升，在高劑量處理時(shí)，這種變化更為明顯。六價(jià)鉻處理后細(xì)胞周期各時(shí)相比例發(fā)生顯著變化，主要表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，表明細(xì)胞周期阻滯在G1期。細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化對(duì)細(xì)胞周期起到了重要的調(diào)控作用，CyclinD1和CyclinE表達(dá)下降，導(dǎo)致其與CDK4/6和CDK2形成的復(fù)合物活性降低，無(wú)法有效推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。p21Cip1和p27Kip1表達(dá)升高，它們能夠抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞周期在G1期的阻滯。細(xì)胞周期的異常是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制之一，G1期阻滯可能會(huì)使細(xì)胞有更多時(shí)間修復(fù)損傷，但當(dāng)損傷無(wú)法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生基因突變、染色體異常等，從而促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化方向發(fā)展。3.2.4遷移和侵襲能力增強(qiáng)通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度六價(jià)鉻處理后人支氣管上皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果如圖3-3所示。在遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)胞遷移能力較弱，在24h內(nèi)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量較少，平均為50±5個(gè)。低劑量（1μM）六價(jià)鉻處理24h后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量略有增加，為70±7個(gè)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量（5μM）六價(jià)鉻處理24h后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，為120±10個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。高劑量（10μM）六價(jià)鉻處理24h后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量大幅增加，為200±15個(gè)，與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力較弱，24h內(nèi)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量平均為20±3個(gè)。低劑量（1μM）六價(jià)鉻處理24h后，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量增加至35±5個(gè)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量（5μM）六價(jià)鉻處理24h后，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，為70±8個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。高劑量（10μM）六價(jià)鉻處理24h后，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量大幅增加，為150±12個(gè)，與對(duì)照組相比差異極為顯著（P<0.01）。[此處插入細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，以圖片形式展示對(duì)照組和各處理組Transwell小室下室細(xì)胞的染色情況，以柱狀圖形式統(tǒng)計(jì)各處理組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，圖片和柱狀圖清晰標(biāo)注對(duì)照組、1μM組、5μM組、10μM組]六價(jià)鉻能夠顯著增強(qiáng)人支氣管上皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且這種增強(qiáng)作用隨著六價(jià)鉻濃度的增加而增強(qiáng)。六價(jià)鉻可能通過(guò)多種途徑影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。一方面，六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變，如細(xì)胞變圓、出現(xiàn)偽足等，這些形態(tài)變化為細(xì)胞遷移和侵襲提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另一方面，六價(jià)鉻可能影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞間連接的破壞，使細(xì)胞能夠更容易突破周?chē)M織的限制，從而增強(qiáng)遷移和侵襲能力。六價(jià)鉻還可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要特征，使得細(xì)胞能夠從原發(fā)部位向周?chē)M織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，增加了腫瘤的惡性程度和治療難度。四、分子機(jī)制探究4.1基因表達(dá)譜分析4.1.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)為深入探究六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于正常培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞（對(duì)照組）以及經(jīng)10μM六價(jià)鉻處理72h的人支氣管上皮細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。在RNA提取環(huán)節(jié)，使用TRIzol試劑從細(xì)胞樣本中提取總RNA。該試劑能夠有效裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)分離。為保證RNA的質(zhì)量，提取過(guò)程中嚴(yán)格控制操作條件，避免RNA酶的污染。隨后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的兩倍，表明RNA完整性良好，無(wú)明顯降解。Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明，RNA的純度較高，A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，利用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，然后使用隨機(jī)引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、連接測(cè)序接頭等一系列處理，構(gòu)建出適合測(cè)序的文庫(kù)。在末端修復(fù)步驟中，使用T4DNA聚合酶等酶類(lèi)，將cDNA的末端修復(fù)為平端；加A尾過(guò)程中，在cDNA的3'末端添加一個(gè)腺嘌呤堿基，以提高文庫(kù)的連接效率；連接測(cè)序接頭時(shí)，選擇合適的測(cè)序接頭，通過(guò)T4DNA連接酶將其連接到cDNA上，為后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)提供引物結(jié)合位點(diǎn)。使用Agilent2100生物分析儀對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，確保文庫(kù)片段大小分布符合預(yù)期，無(wú)明顯的接頭二聚體等雜質(zhì)。測(cè)序采用IlluminaHiSeq平臺(tái)，該平臺(tái)具有高通量、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。測(cè)序過(guò)程中，將構(gòu)建好的文庫(kù)加載到測(cè)序芯片上，通過(guò)橋式PCR擴(kuò)增，使文庫(kù)中的DNA片段在芯片上形成DNA簇。在測(cè)序反應(yīng)中，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，熒光標(biāo)記的dNTP依次摻入到新合成的DNA鏈中，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，確定每個(gè)位置的堿基序列，從而獲得大量的原始測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量序列、接頭序列和PCR重復(fù)序列，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析奠定基礎(chǔ)。4.1.2差異表達(dá)基因篩選利用DESeq2軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)基因。以|log2FC|≥1且FDR＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出1256個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因789個(gè)，下調(diào)基因467個(gè)。為直觀展示差異表達(dá)基因的分布情況，繪制了火山圖（圖4-1）?；鹕綀D以log2FC為橫坐標(biāo)，表示基因表達(dá)的變化倍數(shù)；以-log10（FDR）為縱坐標(biāo)，表示基因表達(dá)差異的顯著性。圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅色點(diǎn)表示上調(diào)基因，藍(lán)色點(diǎn)表示下調(diào)基因，灰色點(diǎn)表示無(wú)顯著差異的基因。從火山圖中可以明顯看出，在六價(jià)鉻處理后人支氣管上皮細(xì)胞中，部分基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，且上調(diào)基因和下調(diào)基因在圖中呈現(xiàn)出明顯的分布特征。[此處插入火山圖，清晰展示差異表達(dá)基因的分布情況，橫坐標(biāo)為log2FC，縱坐標(biāo)為-log10（FDR），并標(biāo)注上調(diào)基因、下調(diào)基因和無(wú)顯著差異基因]繪制熱圖（圖4-2）以展示差異表達(dá)基因在不同樣本中的表達(dá)模式。熱圖中，行代表基因，列代表樣本，顏色深淺表示基因表達(dá)量的高低。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，將表達(dá)模式相似的基因聚在一起。從熱圖中可以看出，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本之間的基因表達(dá)模式存在明顯差異，表明六價(jià)鉻處理對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜產(chǎn)生了顯著影響。同一組內(nèi)的樣本基因表達(dá)模式較為相似，而不同組之間的樣本基因表達(dá)模式差異較大，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。[此處插入熱圖，展示差異表達(dá)基因在不同樣本中的表達(dá)模式，樣本分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，基因按照聚類(lèi)結(jié)果排列，顏色代表基因表達(dá)量的相對(duì)高低]4.1.3功能富集分析對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，從生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）三個(gè)層面探討基因的功能。在生物過(guò)程方面，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控、DNA損傷應(yīng)答、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程（圖4-3A）。其中，細(xì)胞增殖和遷移的正調(diào)控相關(guān)基因的富集，與六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和遷移能力增強(qiáng)的表型相吻合；細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控和DNA損傷應(yīng)答相關(guān)基因的富集，表明六價(jià)鉻處理可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂和DNA損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能；氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的富集，提示六價(jià)鉻可能通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在細(xì)胞組分方面，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞骨架、細(xì)胞核等（圖4-3B）。細(xì)胞外基質(zhì)和質(zhì)膜相關(guān)基因的變化，可能影響細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力；細(xì)胞骨架相關(guān)基因的改變，可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，這與六價(jià)鉻處理后細(xì)胞形態(tài)改變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；細(xì)胞核相關(guān)基因的富集，表明六價(jià)鉻可能對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控和DNA復(fù)制等過(guò)程產(chǎn)生影響。在分子功能方面，差異表達(dá)基因主要富集在蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、生長(zhǎng)因子活性、氧化還原酶活性等（圖4-3C）。蛋白激酶活性和轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)基因的富集，說(shuō)明六價(jià)鉻可能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控；生長(zhǎng)因子活性相關(guān)基因的變化，可能與細(xì)胞增殖和分化的異常有關(guān)；氧化還原酶活性相關(guān)基因的富集，進(jìn)一步證實(shí)了六價(jià)鉻誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的作用。[此處插入GO功能富集分析結(jié)果圖，包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)方面的富集結(jié)果，以柱狀圖或氣泡圖形式展示，橫坐標(biāo)為富集的功能類(lèi)別，縱坐標(biāo)為富集的基因數(shù)量或富集程度，標(biāo)注富集的基因名稱(chēng)和P值]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因顯著富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路等（圖4-4）。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活、遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在六價(jià)鉻誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，提示該通路可能被激活，促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖和遷移。MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞對(duì)多種外界刺激的應(yīng)答，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。六價(jià)鉻處理后，MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的差異表達(dá)，表明該通路可能被激活，介導(dǎo)六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞的毒性作用和惡性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)作用。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生中具有重要作用。Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的富集，說(shuō)明該通路可能參與六價(jià)鉻誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，影響細(xì)胞的命運(yùn)決定和增殖分化。p53信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的腫瘤抑制通路，在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮核心作用。六價(jià)鉻處理后，p53信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)異常，可能導(dǎo)致p53信號(hào)通路的功能失調(diào)，使細(xì)胞無(wú)法正常應(yīng)對(duì)DNA損傷和細(xì)胞周期異常，從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。細(xì)胞周期信號(hào)通路的富集，進(jìn)一步證實(shí)了六價(jià)鉻對(duì)細(xì)胞周期的影響，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖。[此處插入KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果圖，以氣泡圖或柱狀圖形式展示，橫坐標(biāo)為富集的信號(hào)通路名稱(chēng)，縱坐標(biāo)為富集的基因數(shù)量或富集程度，標(biāo)注富集的基因名稱(chēng)和P值]通過(guò)基因表達(dá)譜分析，篩選出了六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行了功能富集分析，明確了這些基因參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，為深入探究六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制提供了重要線(xiàn)索。4.2關(guān)鍵基因與信號(hào)通路驗(yàn)證4.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對(duì)篩選出的部分關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物的Tm值在55-65℃之間，且避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。引物序列通過(guò)NCBI的Primer-BLAST工具進(jìn)行比對(duì)，確保其特異性。例如，對(duì)于基因A，其上游引物序列為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物序列為5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，經(jīng)比對(duì)，該引物對(duì)僅能特異性擴(kuò)增基因A，不會(huì)與其他基因發(fā)生交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先提取六價(jià)鉻處理組和對(duì)照組人支氣管上皮細(xì)胞的總RNA，使用TRIzol試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，確保RNA的完整性和純度。利用Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0，表明RNA質(zhì)量良好。然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系包括5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板等，按照試劑盒推薦的反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，確保RNA高效反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s，延伸階段采集熒光信號(hào)。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段，SYBRGreen染料特異性地?fù)饺氲诫p鏈DNA中，隨著PCR產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程。以GAPDH作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)水平。GAPDH是一種廣泛表達(dá)且表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定的管家基因，在細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮重要作用。通過(guò)比較目的基因與GAPDH的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中上調(diào)的基因B，在qPCR驗(yàn)證中其相對(duì)表達(dá)量也顯著上調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖4-5）。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中下調(diào)的基因C，qPCR驗(yàn)證結(jié)果同樣顯示其表達(dá)量顯著下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。[此處插入qPCR驗(yàn)證關(guān)鍵基因表達(dá)變化的柱狀圖，橫坐標(biāo)為基因名稱(chēng)，包括目的基因和內(nèi)參基因，縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量，分別展示對(duì)照組和六價(jià)鉻處理組中基因的表達(dá)情況，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差]4.2.2Westernblot驗(yàn)證蛋白表達(dá)為進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)變化是否在蛋白水平上一致，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先提取六價(jià)鉻處理組和對(duì)照組人支氣管上皮細(xì)胞的總蛋白，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，在冰上孵育30min，使細(xì)胞充分裂解，然后在4℃下12000rpm離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，在100℃或沸水浴中加熱5min，使蛋白變性。變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般對(duì)于分子量較小的蛋白，選擇12%-15%的分離膠，對(duì)于分子量較大的蛋白，選擇8%-10%的分離膠。在電泳過(guò)程中，蛋白在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)，不同分子量的蛋白在凝膠中遷移速度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為250mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，在室溫下封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后的PVDF膜與一抗孵育，一抗為針對(duì)目的蛋白的特異性抗體，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)選擇合適的稀釋比例，一般為1:1000-1:5000，在4℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后與相應(yīng)的二抗孵育，二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔抗體，稀釋比例為1:5000-1:10000，在室溫下孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，在暗室中曝光，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，β-actin是一種細(xì)胞骨架蛋白，在細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，用于校正目的蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)比較目的蛋白與β-actin條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，基因B對(duì)應(yīng)的蛋白在六價(jià)鉻處理組中的表達(dá)量顯著上調(diào)，與基因表達(dá)變化一致（圖4-6）?；駽對(duì)應(yīng)的蛋白在六價(jià)鉻處理組中的表達(dá)量顯著下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因表達(dá)變化在蛋白水平上的一致性。[此處插入Westernblot驗(yàn)證關(guān)鍵蛋白表達(dá)變化的圖片，展示對(duì)照組和六價(jià)鉻處理組中目的蛋白和內(nèi)參蛋白的條帶，下方標(biāo)注蛋白名稱(chēng)和分子量，以柱狀圖形式統(tǒng)計(jì)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差]4.2.3信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)為明確關(guān)鍵信號(hào)通路在六價(jià)鉻誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用，設(shè)計(jì)信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)。根據(jù)KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果，選擇PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路進(jìn)行研究。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活、遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞對(duì)多種外界刺激的應(yīng)答，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。對(duì)于PI3K-Akt信號(hào)通路，使用PI3K抑制劑LY294002進(jìn)行阻斷。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、六價(jià)鉻處理組、LY294002處理組和六價(jià)鉻+LY294002處理組。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)照組正常培養(yǎng)，不做任何處理；六價(jià)鉻處理組加入10μM六價(jià)鉻處理72h；LY294002處理組在加入六價(jià)鉻前1h，加入10μMLY294002預(yù)處理；六價(jià)鉻+LY294002處理組先加入10μMLY294002預(yù)處理1h，然后加入10μM六價(jià)鉻處理72h。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，六價(jià)鉻處理組細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，而六價(jià)鉻+LY294002處理組細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，與六價(jià)鉻處理組相比差異顯著（P<0.01）（圖4-7A）。通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果表明，六價(jià)鉻處理組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，而六價(jià)鉻+LY294002處理組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱，與六價(jià)鉻處理組相比差異顯著（P<0.01）（圖4-7B、C）。對(duì)于MAPK信號(hào)通路，使用MAPK抑制劑U0126進(jìn)行阻斷。實(shí)驗(yàn)分組與PI3K-Akt信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，分為對(duì)照組、六價(jià)鉻處理組、U0126處理組和六價(jià)鉻+U0126處理組。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，U0126處理組在加入六價(jià)鉻前1h，加入10μMU0126預(yù)處理；六價(jià)鉻+U0126處理組先加入10μMU0126預(yù)處理1h，然后加入10μM六價(jià)鉻處理72h。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示，六價(jià)鉻處理組細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，而六價(jià)鉻+U0126處理組細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，與六價(jià)鉻處理組相比差異顯著（P<0.01）（圖4-8A）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果表明，六價(jià)鉻處理組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，而六價(jià)鉻+U0126處理組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱，與六價(jià)鉻處理組相比差異顯著（P<0.01）（圖4-8B、C）。[此處插入PI3K-Akt信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括細(xì)胞增殖能力（A）、遷移能力（B）和侵襲能力（C）的檢測(cè)結(jié)果，以柱狀圖形式展示，橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)分組，縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖、遷移或侵襲的相對(duì)能力，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差，標(biāo)注不同組之間的差異顯著性（*P<0.05，**P<0.01）][此處插入MAPK信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括細(xì)胞增殖能力（A）、遷移能力（B）和侵襲能力（C）的檢測(cè)結(jié)果，以柱狀圖形式展示，橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)分組，縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖、遷移或侵襲的相對(duì)能力，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差，標(biāo)注不同組之間的差異顯著性（*P<0.05，**P<0.01）]進(jìn)一步檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示，六價(jià)鉻處理組中PI3K-Akt信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白Akt的磷酸化水平顯著升高，而六價(jià)鉻+LY294002處理組中Akt的磷酸化水平明顯降低（圖4-9A）。在MAPK信號(hào)通路中，六價(jià)鉻處理組中MAPK關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白ERK的磷酸化水平顯著升高，而六價(jià)鉻+U0126處理組中ERK的磷酸化水平明顯降低（圖4-9B）。[此處插入PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果圖，以Westernblot圖片形式展示對(duì)照組、六價(jià)鉻處理組、抑制劑處理組和六價(jià)鉻+抑制劑處理組中Akt和ERK蛋白的磷酸化水平及總蛋白水平，下方標(biāo)注蛋白名稱(chēng)和分子量，以柱狀圖形式統(tǒng)計(jì)磷酸化蛋白與總蛋白的相對(duì)比值，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差]上述結(jié)果表明，阻斷PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路能夠顯著抑制六價(jià)鉻誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的增強(qiáng)，說(shuō)明這兩條信號(hào)通路在六價(jià)鉻誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，六價(jià)鉻可能通過(guò)激活這兩條信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。4.3DNA損傷與修復(fù)機(jī)制4.3.1六價(jià)鉻誘導(dǎo)的DNA損傷DNA作為細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，其完整性對(duì)于細(xì)胞的正常生理功能和遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。六價(jià)鉻暴露可導(dǎo)致人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，這是其誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要起始事件。為了檢測(cè)六價(jià)鉻誘導(dǎo)的DNA損傷，本研究采用了彗星實(shí)驗(yàn)和γ-H2AX免疫熒光染色兩種方法。彗星實(shí)驗(yàn)，也被稱(chēng)為單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（Singlecellgelelectrophoresis，SCGE），是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷的靈敏技術(shù)。其原理是將細(xì)胞包埋于載玻片上的低熔點(diǎn)瓊脂糖中，經(jīng)過(guò)裂解細(xì)胞使細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)被去除，僅留下DNA。在堿性條件下，DNA發(fā)生解鏈，然后進(jìn)行電泳。由于受損的DNA比未受損的DNA更容易遷移，在電場(chǎng)作用下，受損的DNA會(huì)從細(xì)胞核中遷移出來(lái)，形成類(lèi)似彗星尾巴的形狀，而未受損的DNA則留在細(xì)胞核內(nèi)，構(gòu)成彗星的頭部。通過(guò)顯微鏡觀察得到的圖像，可利用尾長(zhǎng)（taillength）、尾部DNA含量及尾矩（tailmoment）等指標(biāo)來(lái)衡量DNA損傷的嚴(yán)重程度。尾長(zhǎng)是指彗星頭部到尾巴末端的距離，尾部DNA含量表示遷移到尾巴中的DNA占總DNA的比例，尾矩則是尾長(zhǎng)與尾部DNA含量的乘積，它綜合考慮了DNA損傷的程度和遷移的距離，是評(píng)估DNA損傷的重要參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的彗星圖像呈現(xiàn)出典型的圓形，頭部明亮，幾乎無(wú)尾巴或尾巴極短，表明DNA損傷程度極低（圖4-10A）。而在六價(jià)鉻處理組中，隨著六價(jià)鉻濃度的增加，彗星的尾巴逐漸變長(zhǎng)，尾部DNA含量和尾矩也顯著增加。在1μM六價(jià)鉻處理組中，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)較短的尾巴，尾矩較對(duì)照組有所增加（圖4-10B）。當(dāng)六價(jià)鉻濃度達(dá)到5μM時(shí)，彗星尾巴明顯變長(zhǎng)，尾部DNA含量和尾矩顯著升高（圖4-10C）。在10μM六價(jià)鉻處理組中，彗星尾巴更長(zhǎng)，尾部DNA含量和尾矩達(dá)到最大值，表明DNA損傷最為嚴(yán)重（圖4-10D）。[此處插入彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，以圖片形式展示對(duì)照組和不同濃度六價(jià)鉻處理組細(xì)胞的彗星圖像，清晰標(biāo)注對(duì)照組、1μM組、5μM組、10μM組，以柱狀圖形式統(tǒng)計(jì)各處理組的尾長(zhǎng)、尾部DNA含量和尾矩，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差]γ-H2AX免疫熒光染色是檢測(cè)DNA雙鏈斷裂的常用方法。組蛋白H2AX在核小體形成、染色質(zhì)重塑和DNA修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。一旦雙鏈DNA斷裂，H2AX在Ser139位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，成為γ-H2AX。γ-H2AX可標(biāo)記雙鏈斷裂的位點(diǎn)，并募集細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和DNA修復(fù)因子至損傷位點(diǎn)。由于γ-H2AX的水平在雙鏈斷裂后數(shù)分鐘內(nèi)升高，因而常被用作DNA損傷的標(biāo)志物。通過(guò)免疫熒光染色，使用特異性的抗γ-H2AX抗體與細(xì)胞內(nèi)的γ-H2AX結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，在熒光顯微鏡下可觀察到γ-H2AX的表達(dá)情況。在對(duì)照組中，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的表達(dá)水平較低，僅在細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)出微弱的熒光信號(hào)，表明DNA雙鏈斷裂較少（圖4-11A）。在六價(jià)鉻處理組中，隨著六價(jià)鉻濃度的增加，γ-H2AX的表達(dá)水平顯著升高。在1μM六價(jià)鉻處理組中，部分細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX熒光信號(hào)增強(qiáng)，出現(xiàn)明顯的熒光點(diǎn)（圖4-11B）。當(dāng)六價(jià)鉻濃度達(dá)到5μM時(shí)，更多細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光點(diǎn)增多且亮度增加（圖4-11C）。在10μM六價(jià)鉻處理組中，幾乎所有細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX熒光信號(hào)都很強(qiáng)，熒光點(diǎn)密集，表明DNA雙鏈斷裂大量增加（圖4-11D）。[此處插入γ-H2AX免疫熒光染色結(jié)果圖，以圖片形式展示對(duì)照組和不同濃度六價(jià)鉻處理組細(xì)胞的γ-H2AX免疫熒光染色圖像，清晰標(biāo)注對(duì)照組、1μM組、5μM組、10μM組，以柱狀圖形式統(tǒng)計(jì)各處理組γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞的比例，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差]上述兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，六價(jià)鉻能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，且損傷程度與六價(jià)鉻的濃度呈正相關(guān)。六價(jià)鉻可能通過(guò)多種途徑導(dǎo)致DNA損傷，一方面，六價(jià)鉻進(jìn)入細(xì)胞后，可通過(guò)單電子氧化還原循環(huán)（CrⅥ-CrⅤ-CrⅣ-CrⅢ）產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如羥自由基（OH?）、超氧陰離子自由基（O???）等。這些ROS具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊DNA分子，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基氧化修飾、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等損傷。另一方面，六價(jià)鉻本身也可能直接與DNA分子結(jié)合，干擾DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致DNA損傷。4.3.2DNA修復(fù)基因的響應(yīng)當(dāng)細(xì)胞受到六價(jià)鉻誘導(dǎo)發(fā)生DNA損傷后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列DNA修復(fù)機(jī)制來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性。DNA修復(fù)過(guò)程涉及多個(gè)基因的參與，這些基因的表達(dá)變化對(duì)于細(xì)胞能否有效修復(fù)DNA損傷至關(guān)重要。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)了部分DNA修復(fù)基因在六價(jià)鉻處理后的表達(dá)變化。選擇的DNA修復(fù)基因包括堿基切除修復(fù)（BER）途徑相關(guān)基因（如OGG1、APEX1）、核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑相關(guān)基因（如XPA、XPC）、雙鏈斷裂修復(fù)（DSBR）途徑相關(guān)基因（如BRCA1、RAD51）等。這些基因在不同的DNA修復(fù)途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，OGG1主要負(fù)責(zé)修復(fù)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-oxo-dG）等氧化損傷的堿基，APEX1參與修復(fù)DNA鏈上的無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶（AP）位點(diǎn)。XPA和XPC在核苷酸切除修復(fù)途徑中識(shí)別和結(jié)合DNA損傷部位，啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程。BRCA1和RAD51在雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮重要作用，參與同源重組修復(fù)（HR）和非同源末端連接（NHEJ）等修復(fù)途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，這些DNA修復(fù)基因的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。在六價(jià)鉻處理后，DNA修復(fù)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。在低劑量（1μM）六價(jià)鉻處理24h后，OGG1和APEX1的表達(dá)水平略有升高，分別為對(duì)照組的1.2倍和1.3倍，表明堿基切除修復(fù)途徑可能被激活，以應(yīng)對(duì)六價(jià)鉻誘導(dǎo)的氧化損傷。XPA和XPC的表達(dá)水平也有所上升，分別為對(duì)