T-GXTC 0015-2024 菠蘿蜜抗寒基因挖掘技術(shù)規(guī)范 基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

ICSCCS65.020.99GXTCTechnicalspecificationofjickfruitcoldresistancegeneminingbasedontranscriptomesequencingtechnIT/GXTC0015—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所提出并宣貫。本文件由廣西熱帶作物學(xué)會歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所。本文件主要起草人：杜英俊、朱鵬錦、唐秀觀、鐘云婕、何江、歐景莉、葉維雁。1T/GXTC0015—2024菠蘿蜜抗寒基因挖掘技術(shù)規(guī)范基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)本文件界定了菠蘿蜜抗寒基因挖掘基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的術(shù)語和定義，給出了技術(shù)原理，并規(guī)定了儀器設(shè)備及試劑、品種選擇與使用、轉(zhuǎn)錄組測序流程、生物信息學(xué)分析的要求。本文件適用于篩選菠蘿蜜抗寒基因。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T35890高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1轉(zhuǎn)錄組測序transcriptomesequencing通過二代測序平臺快速全面地獲得某一物種特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本及基因序列，可以用于研究基因表達(dá)量、基因功能、結(jié)構(gòu)、可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測等。3.2fastq格式fastqformat基于文本的、保存生物序列（通常是核酸序列）和其測序質(zhì)量信息的、每四行表示一條序列的標(biāo)準(zhǔn)格式。3.3質(zhì)量控制qualitycontrol對測序儀下機的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，具體內(nèi)容包括含N比例、GC含量、序列重復(fù)情況、序列長度分布情況、堿基平衡情況等。3.4測序片段sequencingfragment高通量測序平臺產(chǎn)生的含有堿基序列和質(zhì)量值的序列片段。3.5差異表達(dá)基因differentiallyexpressedgenes（DEGs）通過閾值法、統(tǒng)計法或者其他檢驗方法，篩選出組間的表達(dá)水平存在顯著差異的基因。3.6差異倍數(shù)foldchange根據(jù)同一個基因或轉(zhuǎn)錄本在不同條件下表達(dá)豐度差異的倍數(shù)。4原理根據(jù)基因在不同樣品中的表達(dá)量識別差異表達(dá)基因，并對其進(jìn)行功能注釋和富集分析，篩選差異表達(dá)基因。5儀器設(shè)備及試劑2T/GXTC0015—2024儀器：Illumina高通量測序平臺、瓊脂糖凝膠電泳儀、分光光度計、熒光計、生物分析儀。試劑：RNA提取試劑盒。6品種選擇與使用6.1品系選取選取生長勢一致耐寒品系(GXRZBLM00051，編號為A)和不耐寒品系(GXRZBLM00006，編號為B),低溫脅迫（3℃~4℃)后A正常生長發(fā)育，沒有出現(xiàn)寒害癥狀；而B出現(xiàn)寒害癥狀，其葉背面出現(xiàn)水浸狀斑塊，葉組織變成褐色或深褐色，后呈現(xiàn)青枯狀。6.2樣品制備分別選取兩個品系的菠蘿蜜各5棵樹，從東南西北四個方向隨機采集葉片，將葉片用去離子水（ddH?O）洗凈后放液氮中速凍，帶回實驗室-80℃凍存。7轉(zhuǎn)錄組測序流程7.1總RNA提取總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，操作按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。7.2RNA檢測度。檢測RNA完整性。7.3文庫構(gòu)建按下列步驟執(zhí)行：b)將RNA打斷成短片段；f)雙鏈cDNA末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭；7.4文庫質(zhì)檢7.4.1初步定量使用熒光計進(jìn)行初步定量，使用生物分析儀對文庫的插入片段長度（insertsize）進(jìn)行檢測，插入片段長度符合預(yù)期后才可進(jìn)行下一步實驗。7.4.2準(zhǔn)確定量運用Q-PCR（熒光定量PCR）方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度＞2nM完成庫檢。7.5上機測序庫檢合格后，用Illumina平臺進(jìn)行測序，測序后得到原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)為fastq格式。3T/GXTC0015—20248生物信息學(xué)分析步驟8.1測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量控制8.1.1測序數(shù)據(jù)過濾過濾流程如下：8.1.2測序錯誤率分布測序錯誤率計算公式如式（1）:式中:e——測序錯誤率。8.1.3GC含量分布檢查測序讀段在每個位置的GC及AT含量應(yīng)分別相等，且在整個測序過程基本穩(wěn)定不變。8.2轉(zhuǎn)錄本拼接8.2.1拼接無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序，采用Trinity軟件對cleanreads（經(jīng)過處理后去除低質(zhì)量、含有接頭的reads）進(jìn)行拼接以獲取后續(xù)分析的參考序列。8.2.2Corset聚類使用Corset比對轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)和表達(dá)模式，對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行層次聚類，層次聚類后的序列信息以FASTA格式儲存。8.2.3轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果統(tǒng)計將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列作為后續(xù)分析的參考序列，以Corset層次聚類后得到最長Cluster序8.3基因功能注釋8.3.1NR數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果統(tǒng)計與NR庫的比對，查看本物種轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的相似情況和同源序列的功能信息。8.3.2GO分類對基因進(jìn)行GO注釋之后，將注釋成功的基因按照GO三個大類生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的下一層級進(jìn)行分類。8.3.3KOG分類4T/GXTC0015—2024運用KOG數(shù)據(jù)庫，將功能注釋直接繼承給同一KOG簇的其他成員。8.4CDS預(yù)測對組裝得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行CDS（編碼序列）預(yù)測，按下列步驟進(jìn)行：a)進(jìn)行開放閱讀框（ORF）預(yù)測，默認(rèn)保留氨基酸長度大于100的轉(zhuǎn)錄本。b)將預(yù)測得到的蛋白序列分別和Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫、PFAM蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋，提高CDS預(yù)測的靈敏度。c)結(jié)合蛋白數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，保留和已知蛋白庫有同源性的、可信度得分最高的ORF。8.5基因表達(dá)定量步驟如下：a)將Trinity組裝并去冗余之后的轉(zhuǎn)錄本作為參考序列，將每個樣品的cleanreads（經(jīng)過處理后去除低質(zhì)量、含有接頭的reads）往參考序列上比對。讓片段數(shù)目能真實地反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。c）采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，F(xiàn)PKM計算公式如式（2）：式中：8.5.1樣品基因表達(dá)量整體分布用箱線圖中表示單個樣品基因表達(dá)水平分布的離散程度。用密度圖展示樣品中基因豐度隨著表達(dá)量變化的趨勢。用小提琴圖展示多組數(shù)據(jù)的分布狀態(tài)以及概率密度。8.5.2樣品相關(guān)性分析將皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評估指標(biāo)。生物學(xué)重復(fù)樣品間R2≥0.8。8.5.3主成分分析運用主成分分析（PCA）從原始變量中導(dǎo)出少數(shù)幾個主成分，將原來多個指標(biāo)作線性組合，作為新的綜合指標(biāo)。8.6差異基因篩選8.6.1差異表達(dá)基因分析和篩選條件設(shè)置按下列步驟執(zhí)行：a)有生物學(xué)重復(fù)的樣品，使用DESeq2進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析；無生物學(xué)重復(fù)的樣品使用FPKM等經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)。b)對假設(shè)檢驗概率（Pvalue）進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正，得到錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）。8.6.2基因上的reads原始計數(shù)對比對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，得到每個樣品比對到每個基因上的reads數(shù)目。5T/GXTC0015—20248.6.3差異基因數(shù)量統(tǒng)計統(tǒng)計每組的差異基因總數(shù)、上調(diào)基因數(shù)、下調(diào)基因數(shù)。8.6.4差異基因信息匯總對每個差異分組計算得到差異基因信息進(jìn)行統(tǒng)計匯總。8.6.5差異基因M-versus-Aplot分析利用MA圖分析基因的表達(dá)水平和差異倍數(shù)的整體分布。8.6.6差異基因volcanoplot分析利用火山圖分析兩組樣品中差異基因的整體分布情況。8.6.7基因表達(dá)聚類分析將各比較組合差異基因做層次聚類分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。8.7差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析8.7.1差異表達(dá)基因功能注釋將基因注釋到KEGG、GO、KOG數(shù)據(jù)庫后，統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫中每個通路包含的差異基因數(shù)量。8.7.2差異表達(dá)基因KEGG富集分析8.7.2.1Pathway（通路）顯著性富集分析以KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway為單位，找出與整個基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。8.7.2.2對KEGG的Pathway進(jìn)行解析，使用相應(yīng)網(wǎng)頁來展示KEGG富集通路。8.7.2.3KEGG富集程度通過Richfactor（指該通路中富集到的差異基因個數(shù)與注釋到該通路所有基因個數(shù)的比值）、Qvalue（Q值）和富8.7.3差異表達(dá)基因GO富集分析8.7.3.1將差異表達(dá)基因按照GO三個大類生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的下一層級進(jìn)行分類。8.7.3.2找出與整個基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集