注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫生產(chǎn)工藝的研究資料及驗證資料

藥品名稱注射用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞資料項目名稱種子細(xì)胞生產(chǎn)工藝的研究資料及驗證資料（5.0×107）資料項目編號 5 5 7 胞備用。凍存前產(chǎn)品通過檢測細(xì)胞形態(tài)，計數(shù)，活率鑒別，無菌，支原體等微生物檢查，成骨成脂誘導(dǎo)分等。培養(yǎng)基的主要成份為氨基酸，碳水化合物，無機表表9-1培養(yǎng)基選擇方案一覽表SY-M-AHL-1TM完全無血清培養(yǎng)基UltraCHOTM培養(yǎng)基UltraMDCKTM培養(yǎng)基北京百樂通ABCDEF無血清培養(yǎng)基胞的形態(tài)、融合度以及細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，篩選出融A繼續(xù)實驗第六天已有細(xì)胞貼壁生長，但是細(xì)胞形態(tài)較大，細(xì)胞呈衰老現(xiàn)象B舍棄C6-7天開始有細(xì)胞貼壁生長，未見其發(fā)生嚴(yán)重的衰老現(xiàn)象，但是D繼續(xù)實驗貼壁生長的細(xì)胞形態(tài)和A培養(yǎng)基比較相似，P0代細(xì)胞收獲時，E15天后無細(xì)胞貼壁生長，此培養(yǎng)基不適用于臍帶間充質(zhì)組織塊結(jié)論淘汰B和F培養(yǎng)基。A，C，D，E培養(yǎng)基培養(yǎng)基編號臍帶編號A1123平均值CDEA培養(yǎng)基A培養(yǎng)基P0代細(xì)胞的收獲量為最大，E次之，C表9－4不同培養(yǎng)基中收獲的P1代細(xì)胞計數(shù)結(jié)果/T75培養(yǎng)基臍帶編號A1123平均值CDEA培養(yǎng)基收獲的A培養(yǎng)基收獲的P1代細(xì)胞數(shù)量最多，E次之，C、D最少。表9-5不同培養(yǎng)基中收獲的P2代細(xì)胞計數(shù)結(jié)果/T75臍帶編號123ACDE結(jié)論A培養(yǎng)基收獲的P2代細(xì)胞數(shù)量最多，E次之，C表A培養(yǎng)基培養(yǎng)下P2代細(xì)胞的檢測結(jié)果表臍帶HLA-DR臍帶一臍帶二臍帶三符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。 臍帶一 試劑英文名來源試劑英文名來源供應(yīng)商試劑中文名液氮凍存是細(xì)胞長期貯存的主要方法。凍存過程細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷[7]。[8]。三組不同濃度的凍存方案進 （1）從液氮中取出凍存管，立即投入恒溫水浴箱的溫水（40℃)中輕輕晃動，直表表9-8凍存液篩選活率實驗結(jié)果凍存前樣品細(xì)胞活率平均值樣品4復(fù)蘇后細(xì)胞活率實驗組根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻報道，我們選取目前常臍帶華通氏膠培養(yǎng)，收獲P0代細(xì)胞細(xì)胞種瓶組織勻漿P1代細(xì)胞洗滌臍帶華通氏膠CO2恒溫恒濕箱細(xì)胞培養(yǎng)P1代細(xì)胞消化，收獲P0細(xì)胞胰蛋細(xì)胞換液細(xì)胞種瓶組織勻漿表表9-9不同生產(chǎn)工藝獲得的P0代細(xì)胞實驗結(jié)果序考察指標(biāo)樣本膠原酶消化法組織塊貼壁法號1（個/克膠體）臍帶樣本2臍帶樣本366562數(shù)（天）臍帶樣本2臍帶樣本33P0代細(xì)胞臍帶樣本1生長形態(tài)臍帶樣本2胞漿透亮，胞體較小，透亮，胞體較小，立體感表面抗原分析指標(biāo)酶消化法組織塊貼壁法臍帶一臍帶二臍帶三表臍帶一臍帶二臍帶三得的生物制劑，往往還含有其他的酶，對細(xì)胞有產(chǎn)工藝的差異可能導(dǎo)致酶活性出現(xiàn)較大差異，即影響酶本身的活性，另外酶的濃度、體積、作用和活率，以上原因均可導(dǎo)致酶消化法生產(chǎn)工藝路一般區(qū)域萬級區(qū)供體篩查一般區(qū)域萬級區(qū)供體篩查采集器準(zhǔn)備臍帶采集臍帶交接(醫(yī)院)臍帶運輸臍帶交接(實驗室）無菌試劑器械準(zhǔn)備臍帶洗滌、剪切剝離獲得華通氏膠凍存液準(zhǔn)備細(xì)胞檢測合格，入庫儲存組織塊制備根據(jù)膠體重量，加入適量專用培養(yǎng)基SY-M-A，定容組織勻漿濃度約為0.5~表9-9主要生產(chǎn)過程工藝參數(shù)一覽表1234華通氏膠的分離和培養(yǎng)細(xì)胞傳代（P1代）關(guān)鍵控制項目組織勻漿接種密度培養(yǎng)基用量培養(yǎng)收獲天數(shù)細(xì)胞融合度消化酶用量消化時間傳代密度培養(yǎng)基用量培養(yǎng)時間細(xì)胞融合度消化酶用量消化時間傳代密度培養(yǎng)基用量培養(yǎng)時間細(xì)胞融合度消化酶用量消化時間凍存密度控制參數(shù)2222222277個/ml表9-10主要生產(chǎn)過程質(zhì)控參數(shù)一覽表樣品樣品質(zhì)控方法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法速率法每份每份每份每份每份HIV-1/2抗體臍帶樣本臍帶樣本檢測Anti-TPALT華通氏膠末次洗滌消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液及上清細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液支原體臍帶保存液支原體需氧菌及真菌厭氧菌及真菌貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞活率及真菌厭氧菌及真菌支原體間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分析染色體檢查成骨、成脂誘導(dǎo)分化潛能全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞計數(shù)儀檢測全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法培養(yǎng)法及DNA染色法流式細(xì)胞術(shù)G顯帶核型分析染色法呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞不得檢出呈梭形，應(yīng)為纖維樣細(xì)胞標(biāo)示量的符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定每批每批每批每批每批每批每批每批每批每批每批每批每批每批每批細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液原癌基因、抑癌基因分析端粒酶活性實時熒光定量端粒重復(fù)序列擴增法符合規(guī)定符合規(guī)定每批每批采用現(xiàn)有生產(chǎn)工藝進行三批中試規(guī)模生產(chǎn)，對證，并選取活率、計數(shù)、細(xì)胞表面抗原分析、無菌凍存前細(xì)胞為本次再驗證實驗的關(guān)鍵節(jié)點，開展活率、菌、支原體檢查、誘導(dǎo)分化、原癌基因及抑癌基因分析表9-11主要生產(chǎn)過程工藝參數(shù)一覽表氏膠氏膠的分離和培養(yǎng)細(xì)胞的收獲傳關(guān)鍵控制組織勻漿接種密度培養(yǎng)基控制參數(shù)22222222融合度代傳代凍存消化酶消化時間傳代密度培養(yǎng)基培養(yǎng)時間融合度消化酶消化時間傳代密度培養(yǎng)基培養(yǎng)時間融合度消化酶消化時間凍存密度22222100μm篩網(wǎng)濾過7個/ml2222222222222227個/ml樣品檢測華通氏膠末次洗滌消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前質(zhì)控項目臍帶保存液HIV-1/2抗體Anti-TPALT支原體需氧菌及真菌厭氧菌及真菌貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率貼壁細(xì)胞形態(tài)質(zhì)控方法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法速率法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法鏡下觀察標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定成纖維樣細(xì)胞檢出成纖維樣細(xì)胞檢出成纖維樣細(xì)胞檢測結(jié)果符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞計數(shù)儀檢測全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法細(xì)胞活率需氧菌及真菌厭氧菌及真菌細(xì)胞活率需氧菌及真菌厭氧菌及真菌支原體間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分析染色體檢查成骨、成脂誘導(dǎo)分化潛能原癌基因、抑癌基因分析端粒酶活性符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液及上清細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液DNA染色法符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定G顯帶核型分析染色法實時熒光定量符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定端粒重復(fù)序列擴增法符合規(guī)定符合規(guī)定樣品檢測華通氏膠末次質(zhì)控項目液HIV-1/2抗體Anti-TPALT支原體需氧菌及真菌質(zhì)控方法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法速率法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測結(jié)果符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定洗滌上清消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液及上清細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液厭氧菌及真菌貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞活率及真菌厭氧菌及真菌支原體間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分析染色體檢查成骨、成脂誘導(dǎo)分化潛能原癌基因、抑癌基因分析端粒酶活性全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞計數(shù)儀檢測全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法培養(yǎng)法及DNA染色法流式細(xì)胞術(shù)（FCM）G顯帶核型分析染色法實時熒光定量端粒重復(fù)序列擴增法呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞檢出呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞檢出呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞標(biāo)示量的符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定工藝質(zhì)控參數(shù)檢測結(jié)果樣品質(zhì)控項目檢測結(jié)果樣品質(zhì)控項目檢測結(jié)果符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定HIV-1/2HIV-1/2抗體Anti-TPALT酶聯(lián)免疫法標(biāo)本檢測酶聯(lián)免疫法標(biāo)本檢測速率法臍帶支原體液支原體液全自動細(xì)菌分枝桿華通氏膠末次洗滌消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液含細(xì)胞的培養(yǎng)液消化收集細(xì)胞前細(xì)胞懸液符合規(guī)定菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢符合規(guī)定菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法需氧菌及真菌呈梭形，應(yīng)為呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞檢出呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞檢出呈梭形，應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞標(biāo)示量的符合規(guī)定厭氧菌及真菌符合規(guī)定符合規(guī)定貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率符合規(guī)定符合規(guī)定鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)儀檢測直接培養(yǎng)法符合規(guī)定貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞活率符合規(guī)定符合規(guī)定鏡下觀察符合規(guī)定鏡下觀察符合規(guī)定貼壁細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液及上清細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞活率需氧菌及真菌厭氧菌及真菌支原體間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分析染色體檢查成骨、成脂誘導(dǎo)分化潛能原癌基因、抑癌基因分析端粒酶活性細(xì)胞計數(shù)儀檢測全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢全自動細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢培養(yǎng)法及DNA染色法G顯帶核型分析染色法實時熒光定量