數(shù)字PCR技術(shù)及應(yīng)用

數(shù)字PCR技術(shù)及應(yīng)用數(shù)字PCR是繼實時定量PCR之后新興發(fā)展起來的一種絕對定量分析技術(shù)。通過將單個DNA分子轉(zhuǎn)移入獨立的反應(yīng)室，PCR擴增反應(yīng)后，對熒光信號進行檢測分析，實現(xiàn)單分子的絕對定量。數(shù)字PCR技術(shù)擺脫了對標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確度，在基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及下一代測序等方面均得到廣泛應(yīng)用。1999年，美國學(xué)者KennethKinzler與BertVogelstein首次提出了“數(shù)字PCR(DigitalPCR，dPCR)”的概念，該技術(shù)實現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)絕對定量的突破。其主要特點在于將目標(biāo)分子分散入單個反應(yīng)室中，使每個反應(yīng)室中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子，是實現(xiàn)數(shù)字PCR高靈敏度和高準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。1技術(shù)原理數(shù)字PCR主要原理是將單個DNA分子置于獨立的反應(yīng)室中，幵對其迚行PCR擴增，利用TaqMan?化學(xué)試劑及染料標(biāo)記探針檢測特定的靶序列，通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應(yīng)單元比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學(xué)分析，實現(xiàn)樣品的絕對定量。因此，數(shù)字PCR也稱單分子PCR，其檢測過程主要包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴增和熒光信號分析。在PCR反應(yīng)前，將樣品分散至幾萬個單元(反應(yīng)室)中，使每個單元中只存在單個DNA分子。PCR擴增階段的擴增程序、擴增體系與普通PCR幵沒有什么不同。在熒光信號分析階段，采用終端檢測，是對每個反應(yīng)單元的熒光信號迚行采集，然后直接計數(shù)或者借用泊松統(tǒng)計得到樣品的原始濃度或含量(圖1)。與實時熒光定量PCR不同的是，整個數(shù)字PCR過程不需要擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線和看家基因，具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)真正意義上的絕對定量?；诜忠悍绞降牟煌瑪?shù)字PCR主要分為3種：微流體數(shù)字PCR(MicrofluidicdigitalPCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)和芯片數(shù)字PCR(ChipdigitalPCR，cdPCR)。分別通過微流體通道、微液滴或微流體芯片實現(xiàn)分液，分隔開的每個微小區(qū)域都可進行單獨的PCR反應(yīng)，其中mdPCR基于微流控技術(shù)，對DNA模板進行分液，微流控技術(shù)能實現(xiàn)樣品納升級或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代；ddPCR技術(shù)，是相對成熟的數(shù)字PCR平臺，利用油包水微滴生成技術(shù)，目前的儀器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)，其中Bio-rad公司的dPCR系統(tǒng)利用油包水生成技術(shù)將含有核酸分子的反應(yīng)體系生成20000個納升級微滴，經(jīng)PCR擴增后，微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測；cdPCR利用微流控芯片技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離和檢測等集成到一塊芯片上，目前的儀器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark?基因分析系統(tǒng)和LifeTechnologies公司的QuantStudio系統(tǒng)。利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實現(xiàn)生物樣品的分液、混合、PCR擴增，實現(xiàn)絕對定量。2數(shù)字PCR的優(yōu)勢傳統(tǒng)PCR技術(shù)是將目的基因經(jīng)過PCR擴增循環(huán)，一個DNA分子模板復(fù)制成成千上萬的子代雙螺旋，然后用凝膠電泳進行檢測。但是，凝膠電泳檢測只能對擴增產(chǎn)物的分子大小進行判斷，而無法推斷出起始樣品中DNA的含量，因此無法進行定量分析；實時熒光定量PCR可以進行絕對定量和相對定量，其中絕對定量是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，從而得到目的基因的量，標(biāo)準(zhǔn)品可選擇純化的質(zhì)粒DNA或體外合成的ssDNA等，相對定量通過內(nèi)參等進行換算起始樣品中DNA的相對含量。數(shù)字PCR是基于傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第3代PCR技術(shù)，它不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即能實現(xiàn)更靈敏、更準(zhǔn)確的絕對定量。數(shù)字PCR高精確度的另一個重要因素是將泊松統(tǒng)計引入數(shù)字PCR的檢測應(yīng)用中。由于數(shù)字PCR是一種終端檢測的分析方法，如果目標(biāo)分子沒有得到很好的離散，在一個反應(yīng)室中不止存在一個靶DNA，那么得到的濃度便不可信。泊松統(tǒng)計是對隨機分布的一種描述方法，當(dāng)反應(yīng)室/液滴量和其中陰性比例已知，即可通過泊松模型獲得初始濃度。所以，如果反應(yīng)室沒有達到飽和，研究者也可以計算樣品的起始分子數(shù)。Beer等的研究表明，基于液滴方法的優(yōu)勢在于其可擴大性，增加反應(yīng)容器的數(shù)量，數(shù)據(jù)的質(zhì)量也就隨之增大。即當(dāng)擴大或增加了反應(yīng)容器的數(shù)量時，泊松精度也隨之提升。同時，數(shù)字PCR能夠有效避免反應(yīng)抑制劑的影響。隨著反應(yīng)室的增加，反應(yīng)受到抑制劑的影響就越小。3數(shù)字PCR的應(yīng)用據(jù)KaloramaInformation發(fā)布的研究報告顯示，2019年全球數(shù)字PCR和qPCR市場預(yù)計將達到39.7億美元，中國是最主要的新興市場。3.1在突變檢測方面的應(yīng)用常規(guī)組織和血液等樣品中，由于單個突變的體細胞含量低，使得檢出其的存在變得困難。而dPCR可對復(fù)雜的大背景進行有限的稀釋或分區(qū)，通過有限稀釋，降低野生基因型的背景信號，使得低豐度的目的序列能夠被靈敏的檢出，特別適用于稀有突變的檢測應(yīng)用。研究表明，低至1/100000的變異頻率能被檢測出來。并且隨著反應(yīng)室數(shù)量的增加，對稀有變異的分析更靈敏。dPCR在稀有突變檢測方面有廣泛的應(yīng)用和研究，尤其是與癌癥相關(guān)的檢測和定量研究，如EGFR、BRAF、KRAS、PIK3CA、JAK2和miRNAs等。PIK3CA可由IGF-1、HGF、EGF等生長因子激活，與生長因子一同作用于受體酪氨酸激酶，促進增殖、血管生成和細胞的新陳代謝。Kim等用ddPCR對血清中游離的DNA進行PIK3CA突變的檢測分析，血清中低豐度的PIK3CA突變成功被檢測出來。對38份轉(zhuǎn)移性膽道癌樣品進行試驗，匹配的一份血清樣品PIK3CAp.E542K對28突變拷貝呈陽性，相當(dāng)于48copies/mL血清和0.3%的等位基因的患病率；另一血清樣品PIK3CAp.H1047R對10突變拷貝呈陽性，相當(dāng)于18copies/mL血清和0.2%的等位基因的患病率。Miotto等研究表明EvaGreen染料法和TaqMan探針法均可用于人體血漿和血清中循環(huán)miRNA的ddPCR檢測定量。3.2在拷貝數(shù)變異檢測方面的應(yīng)用通?；虮磉_分析依賴于瓊脂糖凝膠電泳、realtimePCR等方法，拷貝數(shù)的確定總是受到限制。而使用dPCR進行直接計數(shù)目標(biāo)基因和參照基因的雙重反應(yīng)，通過計算比值，便直接得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。影響HIV感染和疾病進展的CCL3編碼基因拷貝數(shù)變異(Copynumbervariations，CNV)的發(fā)現(xiàn)引起廣泛的爭議，已經(jīng)在一定程度上歸因于拷貝數(shù)評估方法獲得的不同結(jié)果。CCL3基因編碼CC趨化因子CCL4，也是CCR5受體的自然配體，對HIV-1起到了保護作用。Bharuthram等用標(biāo)準(zhǔn)方法qPCR和ddPCR對CCL4L基因拷貝數(shù)進行評估測定。研究表明，與qPCR(r=0.87，P<>相比，由ddPCR測得CCL4L拷貝與CCL4L1和CCL4L2拷貝之和具有良好的相關(guān)性(r=0.99，P<>。而qPCR在高拷貝數(shù)時出現(xiàn)準(zhǔn)確性明顯下降。Whale等模擬不同CNVs的HER2基因擴增，相同試驗條件下，dPCR能夠檢測比qPCR更低的CNVs。由于dPCR準(zhǔn)確度與擴增大小和模板濃度是直接相關(guān)性的，他們也建立了用于測量CNV的dPCR方法。利用泊松和二項分布，得出dPCR的方差表達式。3.3在微生物檢測方面的應(yīng)用核酸擴增技術(shù)是病原微生物檢測的一個重要方法，但可能存在的問題是，有時候低水平目標(biāo)分子和小分子抑制劑的存在使得檢測定量的結(jié)果發(fā)生偏移。dPCR則是一種不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線并且對部分抑制劑不靈敏的檢出方法。因此，研究人員紛紛將其應(yīng)用于一些病毒或致病菌的檢測研究中，如HBV、腸病毒、腺相關(guān)病毒、巨細胞病毒、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、結(jié)核分支桿菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌等。Strain等采用ddPCR和qPCR對HIV經(jīng)過聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療的病人體內(nèi)殘留的DNA進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，ddPCR具有更高的精確度和更低的拷貝變異系數(shù)。Dong等對E.coliO157:H7的rfbE基因建立ddPCR，優(yōu)化探針濃度，在20μL體系中，對E.coliO157:H7基因組DNA的檢測范圍為4?1.25×105copies，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。同時用ddPCR和qPCR對16份實際樣品進行檢測得到相同結(jié)果。在環(huán)境檢測方面，dPCR也得到相應(yīng)的應(yīng)用。Josefa等在對土壤、植物根莖樣品中煙草疫霉菌的低拷貝DNA定性定量的研究發(fā)現(xiàn)，與qPCR相比，dPCR對反應(yīng)抑制劑更不敏感。由于基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的realtimePCR方法在檢測方面帶來的偏差，Cao等利用雙重ddPCR同時檢測糞源和水質(zhì)中的腸球菌和人源糞便相關(guān)標(biāo)記HF183。qPCR中雙重的腸球菌和HF183相互競爭使得其無檢出或超出其單重最低檢測濃度范圍，而ddPCR的單重和雙重檢測結(jié)果一致。其對抑制劑的較高耐受性、重復(fù)性、檢測靈敏度以及準(zhǔn)確度均比qPCR高，但是其定量上限較realtimePCR低。Anja等將ddPCR與qPCR聯(lián)合起來使用，用ddPCR制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用realtimePCR進行定量，成功實現(xiàn)對不同生物膜形成時期的單增李斯特菌定量檢測。3.4在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面的應(yīng)用歐盟國家對轉(zhuǎn)基因食品有著嚴格的限定，而目前，一般采用實時定量PCR用于商品中轉(zhuǎn)基因的分子定量分析。但是在一些復(fù)雜的食物原料和飼料原材料中，目標(biāo)DNA非常少，使得對其的檢測和定量受到限制。dPCR為國內(nèi)外研究人員提供了新的方法。Morisset等用ddPCR對MON810轉(zhuǎn)基因和hmg玉米參考基因進行絕對定量。研究表明，ddPCR對低濃度的檢測具有更高的重復(fù)性，并且對抑制劑具有更高耐受性。Dobnik等用多重ddPCR檢測定量12個歐盟授權(quán)轉(zhuǎn)基因玉米，對于含轉(zhuǎn)基因組織樣品中，該方法比實時定量PCR更高通量、更高效。Damira等建立雙重ddPCR用于檢測定量轉(zhuǎn)基因玉米中T-nos/hmg基因的拷貝數(shù)比例，通過中心復(fù)合設(shè)計優(yōu)化，并在體系中加入DNA消化酶減小檢測偏差，所建立的方法T-nos檢測限為11拷貝，T-nos/hmg比例的動態(tài)范圍為0.08%–100%。3.5在下一代測序方面的應(yīng)用下一代測序(NGS)又叫高通量測序，是測序技術(shù)革命性的進步，能一次上百萬條DNA分子進行序列測定，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和全基因組進行細致全貌的分析成為現(xiàn)實。dPCR平臺可以與NGS對接，實現(xiàn)對測序文庫的質(zhì)量控制、提供對測序文庫的定量分析和質(zhì)量評估信息。一方面，dPCR對NGS的測序結(jié)果進行驗證，對諸如單核苷酸多態(tài)性，突變及拷貝數(shù)變異在內(nèi)的基因組變異進行驗證，確保測序結(jié)果的可信度；另一方面，所得到的結(jié)果還包含反映測序文庫質(zhì)量的信息，如接頭與接頭二聚體、錯誤連接片段、過長連接片段等，這是當(dāng)前其他方法所不具備的優(yōu)勢。Alikian等研究表明，在慢性粒細胞白血病患者的檢測中，dPCR比qPCR更準(zhǔn)確，定量分析結(jié)果可靠性高、重復(fù)性好。dPCR與普通PCR、qPCR相比具有獨特的技術(shù)優(yōu)勢，實現(xiàn)了單分子DNA絕對定量，使其成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，研究者對其應(yīng)用分析也日益關(guān)注。近期，相應(yīng)的分析軟件有所突破，美國已推出一款ddpcr軟件可用于使用者分析dPCR數(shù)據(jù)，免費在線網(wǎng)址為/shiny/ddpcr/。軟件及網(wǎng)站的建立為dPCR技術(shù)的推廣和應(yīng)用提供重要支持。未來如果能有效解決