第二章-基因工程制藥123節(jié)

第二章

基因工程制藥第一節(jié)概述第二節(jié)基因藥物生產(chǎn)的過(guò)程第三節(jié)目的基因的獲得第四節(jié)基因表達(dá)第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性第七節(jié)基因工程菌中試第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)第九節(jié)高密度發(fā)酵第十節(jié)基因工程藥物的分離純化第十一節(jié)變性蛋白的復(fù)性第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。1982年人胰島素在美國(guó)的問(wèn)世，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。生物技術(shù)用于疾病的預(yù)防和疑難雜癥的治療已經(jīng)成為了現(xiàn)實(shí)傳統(tǒng)生物藥物由于來(lái)源及制備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在制備過(guò)程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問(wèn)題，促使人們尋求安全、實(shí)用、療效可靠的新方法來(lái)制備生物藥物基因工程正在逐漸顯示其在生物技術(shù)藥物制備上的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決上述提到的問(wèn)題，從量、質(zhì)上都可以得到改進(jìn)，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過(guò)基因工程技術(shù)獲得基因工程新藥的主要蛋白和多肽：①免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體②細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激因子、③激素，如胰島素、生長(zhǎng)素、心納素④酶類，如尿激酶、超氧化物歧化酶心納素一種由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，又稱心房利鈉因子(ANF)或心房利鈉肽(ANP)。具有強(qiáng)大的利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓和對(duì)抗腎素－血管緊張素系統(tǒng)和抗利尿激素作用細(xì)胞因子細(xì)胞因子的術(shù)語(yǔ)首次提出是20世紀(jì)70年代中期，這一詞曾用于指那些控制分化和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的多肽生長(zhǎng)因子，像干擾素（IFN)和白細(xì)胞介素（IL）就是主要的細(xì)胞因子多肽家族現(xiàn)代概念：細(xì)胞因子是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白或糖蛋白構(gòu)成的多樣性群組，這些分子通常是由機(jī)體微量產(chǎn)生，它們?cè)诓煌募?xì)胞間充當(dāng)化學(xué)通信分子，通過(guò)與特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)，從而激活各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件構(gòu)成調(diào)節(jié)分子中細(xì)胞因子組群的主要蛋白/蛋白家族白介素（IL-1～I(xiàn)L-15）紅細(xì)胞生成素（EPO）干擾素（IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IFN-ψ，

IFN-τ成纖維生長(zhǎng)因子（FGF）集落刺激因子（G-GSF，M-GSF，GM-GSF）白血病控制因子（LIF）腫瘤壞死因子（TFN-α，TFN-β）巨噬細(xì)胞演性蛋白（MIP-1α，MIP-1βMIP-2）神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NGF，BDNF，NT-3，NT-4/5）白小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-α，TGF-β）神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）白小板生成素（TPO）表皮生長(zhǎng)因子(EGF)主要基因工程藥物名稱簡(jiǎn)寫(xiě)作用干擾素IFN抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞介素IL免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)造血集落刺激因子CSF刺激造血紅細(xì)胞生成素EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成、治療貧血腫瘤壞死因子TNF殺死腫瘤細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、參與炎癥和全身性反應(yīng)表皮生長(zhǎng)因子EGF促進(jìn)細(xì)胞分裂、創(chuàng)傷愈合、胃腸道潰瘍防治神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF促進(jìn)神經(jīng)纖維再生骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP骨缺損修復(fù)、促進(jìn)骨折愈合組織纖溶酶激活劑t-PA溶解血栓、治療血栓疾病血凝因子Ⅷ、Ⅸ治療血友病生長(zhǎng)激素GH治療侏儒癥胰島素治療糖尿病超氧化物歧化酶SOD清除自由基、抗組織損傷、抗衰老主要基因工程藥物簡(jiǎn)介人胰島素

胰島素，多肽激素的一種，具有多種生物學(xué)功能，在維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)與控制細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑等方面都有重要作用商品名：甘舒霖藥品名的商品名即不同廠家生產(chǎn)的同一種藥物制劑可以起不同的名稱，具有專有性質(zhì)，不可仿用。商品名經(jīng)注冊(cè)即為注冊(cè)藥品，常用®表示。它是市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，藥品質(zhì)量的標(biāo)志和品牌效應(yīng)的體現(xiàn)。如左旋氧氟沙星是通用名，而“利復(fù)星”、“來(lái)立信”等即是它的商品名人生長(zhǎng)激素（hGH)人生長(zhǎng)激素是人的垂體腺前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖基化多肽激素，主要功能為刺激身體生長(zhǎng)，最近還發(fā)現(xiàn)它對(duì)一些細(xì)胞的增殖和分化以及DNA的合成有直接效應(yīng)注射用的人生長(zhǎng)激素商品名：安蘇萌干擾素（TNF)是一類在同種細(xì)胞中具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受到細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及到RNA和蛋白質(zhì)的合成。

干擾素是一種類似于多肽激素的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，是一種細(xì)胞素根據(jù)抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)的不同，干擾素可分為αβγδ四型α型干擾素又根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同再分為α1b,α2a、α2b等亞型，其區(qū)分表現(xiàn)為個(gè)別氨基酸的差異，如人干擾素α2a的第23位氨基酸賴氨酸殘基，α2b的第23位位精氨酸殘基商品名：尤靖安白細(xì)胞介素（IL)白細(xì)胞介素是由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生的，又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的一類細(xì)胞因子，是重要的免疫調(diào)節(jié)劑到目前為止，IL系列已發(fā)現(xiàn)的有18種，最主要的是IL-2、IL-6、IL-11、IL-12、IL-15商品名：欣美格集落刺激因子（CSF)CSF是一種能參與造血調(diào)節(jié)過(guò)程的糖蛋白分子，故又稱為造血刺激因子或造血生長(zhǎng)因子現(xiàn)在已知的CSF主要有四種粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)

多功能集落刺激因子（Multi-CSF)注射用GM—CSF商品名：吉姆欣紅細(xì)胞生成素（EPO)主要由成年人的腎臟分泌產(chǎn)生，是一種調(diào)節(jié)和維持血液循環(huán)中紅細(xì)胞生理水平的重要激素，也是合成紅細(xì)胞的主要刺激因子

EPO主要·本品用于慢性腎性貧血，也用于多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的貧血和骨髓增生異常及骨癌引起的貧血。對(duì)結(jié)締組織疾病所致的貧血亦有效。商品名：寧紅欣腫瘤壞死因子（TNF)腫瘤壞死因子這一名稱是在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)，觀察到它的抗腫瘤活性而命名的TNF除了抗腫瘤活性外，對(duì)多種正常細(xì)胞還具有廣泛的免疫生物學(xué)活性，如：炎癥活性，免疫調(diào)節(jié)作用，抗病毒、細(xì)菌、真菌等目前TNF主要有三種主要由：激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α

激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-β

由NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒因子TNF-γ組織型纖溶酶原激活劑（t-PA)組織型纖溶酶原激活劑是一種絲氨酸蛋白酶，能激活纖溶酶原生成纖溶酶，纖溶酶水解血凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)、導(dǎo)致血栓溶解，主要用于治療血栓性疾病利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)可用于醫(yī)藥目的的蛋白質(zhì)或活性多肽都是由相應(yīng)的基因合成的基因工程的最大好處就在于它有能力從極端復(fù)雜的機(jī)體細(xì)胞內(nèi)取出所需的基因，將其在體外進(jìn)行剪切拼接、重新組合，然后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞進(jìn)行表達(dá)，從而生產(chǎn)出比原來(lái)多數(shù)百、數(shù)千倍的相應(yīng)蛋白質(zhì)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)（1）可以大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等），為臨床使用提供有效的保障（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除。如白細(xì)胞介素-2的第125位半胱氨酸是游離的，有可能引起-S-S-鍵的錯(cuò)配而導(dǎo)致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細(xì)胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源

基因工程技術(shù)可將不同種類和用途的基因，在原核細(xì)胞中表達(dá)的特性使其不僅在醫(yī)藥，而且在很多行業(yè)中都會(huì)有重要的應(yīng)用。我國(guó)的基因工程藥物我國(guó)基因工程藥物主要集中在仿制上。必須開(kāi)展創(chuàng)新基因工程藥物的研究，如蛋白質(zhì)工程產(chǎn)品、各種融合蛋白、各種細(xì)胞因子突變體和衍生物、小分子功能肽類等?？赏ㄟ^(guò)分子設(shè)計(jì)、有控制的基因修飾及基因合成，創(chuàng)造世界時(shí)原本沒(méi)有的，但生物功能更優(yōu)越的新型基因工程藥物。我國(guó)的生物技術(shù)下游技術(shù)開(kāi)發(fā)落后于上游技術(shù)，上游技術(shù)與國(guó)際水平僅相差3-5年，但下游技術(shù)則至少落后15年以上。我們必須改變這種狀況，加強(qiáng)下游技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)，使之與上游技術(shù)同步發(fā)展，盡量縮短與國(guó)際先進(jìn)水平的差距。第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程基因工程技術(shù)：將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)基因工程基本過(guò)程基因工程藥物制藥的主要程序⒈目的基因的克隆⒉構(gòu)建DAN重組體⒊DAN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌⒋構(gòu)建工程菌⒌工程菌發(fā)酵⒍表達(dá)產(chǎn)物的分離純化⒎產(chǎn)品的檢驗(yàn)等以上程序中的每個(gè)階段都包含若干細(xì)致的步驟，這些程序和步驟將會(huì)隨研究和生產(chǎn)條件的不同而改變獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞產(chǎn)物分離純化除菌過(guò)濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過(guò)程基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成下游：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等下游階段在產(chǎn)業(yè)化中是極其重要的下游階段是將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開(kāi)發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的抗生素和氨基酸發(fā)酵，需要對(duì)影響目的基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析，對(duì)各種影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，同時(shí)建立一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具該過(guò)程中重要的工具便是酶：限制性內(nèi)切酶和連接酶是將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)粒或噬菌體中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌（細(xì)胞）大量復(fù)制目的基因過(guò)程中的重要工具同時(shí)為保證目的基因的正確性，對(duì)目的基因要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析基因表達(dá)系統(tǒng)就是上述的工程菌或細(xì)胞，有原核生物和真核生物兩類表達(dá)系統(tǒng)；選擇基因表達(dá)的系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)蛋白質(zhì)的功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。第三節(jié)目的基因的獲得問(wèn)題：來(lái)源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，為什么不能進(jìn)行直接分離？CentralDogmaofMolecularBiology

中心法則One-waytransferofgeneticinformationfromnucleicacidtoproteiniscallCentralDogmaofMolecularBiologyInformationTransferin

ProkaryotesandEukaryotesProkaryotesEukaryotes第三節(jié)目的基因的獲得對(duì)于目的基因的獲得需要根據(jù)目的基因的來(lái)源采取適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)于真核細(xì)胞來(lái)源的目的基因，是不能直接進(jìn)行分離的。真核細(xì)胞中單拷貝基因僅是染色體DNA中很小一部分(10-5~10-7)，即使多拷貝基因也是極少的，因此從染色體中分離純化目的基因是很困難的另外，原核表達(dá)系統(tǒng)是有局限性的，主要是由于真核基因的內(nèi)含子及基因的后翻譯過(guò)程

真核基因內(nèi)一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即便分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA也不能加工，拼接成成熟的mRNA,因此，不能直接克隆真核基因目前克隆真核基因常用的方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法

一、反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子一反轉(zhuǎn)錄法1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6、cDNA文庫(kù)的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定cDNA克隆示意圖1mRNA的純化分離純化目的基因的mRNA是極其困難的，細(xì)胞內(nèi)含有3種以上的RNA，mRNA占細(xì)胞內(nèi)總RNA總量的2%~5%，相對(duì)分子質(zhì)量大小很不一致，由幾百到幾千個(gè)核苷酸組成細(xì)胞內(nèi)RNA的組成和含量:DNA:95%核內(nèi)，5％細(xì)胞器RNA：75％細(xì)胞質(zhì)，10%核內(nèi)，15%細(xì)胞器rRNA80-85%;tRNA10-15%；mRNA2-5%1mRNA的純化在真核細(xì)胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，長(zhǎng)達(dá)20~250個(gè)腺苷酸，可采用Oligo

dT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來(lái)。洗脫方法是高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合于寡聚dT，再以低鹽溶液和蒸餾水將其洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚dT，可得到較純的mRNATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

AAAAA

AAAAAOligo(dT)纖維素Poly(A)--Oligo(dT)100mMNaCl洗脫rRNA/tRNA10mMTris1mMEDTAPoly(A)mRNATotalRNA2cDNA第一鏈的合成cDNA

為具有與某RNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA即complementary

DNA之縮寫(xiě)一般mRNA都帶有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開(kāi)始cDNA鏈的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP，在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過(guò)測(cè)定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計(jì)算出cDNA的合成效率；在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。3cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3‘末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開(kāi)始合成cDNA第二鏈。此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專一性切除單鏈DNA，因此用它可以切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)切除后，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定4cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有兩類：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如

gt10、

gt11等）。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體pUC及gt11為表達(dá)型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動(dòng)基因順序；而pBR322及gt10為非表達(dá)型載體。在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體cDNA插入片段小于10kb，可選質(zhì)粒載體，如大于10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選

質(zhì)粒（Plasmid）

是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。大腸桿菌T2噬菌體蝌蚪形噬菌體結(jié)構(gòu)模式圖表達(dá)質(zhì)粒pUC第一，具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù);

僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過(guò)程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500~700個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體；具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。

第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段．方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)非表達(dá)質(zhì)粒pBR322

1、具有較小的分子量；它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過(guò)10kb

2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)噬菌體載體

gt10和gt11cDNA文庫(kù)R.Young和R.Davis設(shè)計(jì)的

gt10和gt11是噬菌體克隆載體，可用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。一方面它們具有較高的克隆效率，1ng

cDNA可產(chǎn)生5000個(gè)克隆，另一方面又可容納較大分子量的外源DNA片段因?yàn)楹Y選噬菌斑在技術(shù)操作上較篩選細(xì)菌菌落更方便，因此gt10和gt11類載體在構(gòu)建文庫(kù)時(shí)優(yōu)于質(zhì)粒載體pBR322

gt10載體在合適的宿主中，

gt10載體對(duì)于未攜帶cDNA的噬菌體的裂解生長(zhǎng)有很強(qiáng)的生物學(xué)選擇作用。cDNA插入到gt10中可使噬菌體阻礙物基因（cI）失活。當(dāng)用大腸桿菌c600的突變型hflA（高頻溶原性）作為宿主時(shí)，只有攜帶cDNA插入片段的噬菌體可形成噬菌斑，而在非突變型大腸桿菌c600宿主菌中，帶與不帶cDNA插入片段的噬菌體都可形成噬菌斑。

gt11載體

gt11則沒(méi)有類似gt10載體的選擇作用，但它是蛋白質(zhì)表達(dá)的cDNA克隆載體

gt11的宿主菌是大腸桿菌Y1090。

gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因編碼區(qū)（lacZ）的羧基端，在含IPTG（isopropylthio--D-galactoside,異丙基硫代--D-半乳糖苷）和X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside,5-溴-4氯-3-吲哚--D

-半乳糖苷）的平板上，帶cDNA插入片段的gt11可形成清晰的無(wú)色噬菌斑，未帶cDNA插入片段的gt11則形成藍(lán)色噬菌斑。cDNA插入片段的翻轉(zhuǎn)產(chǎn)物可表達(dá)成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白cDNA片段與載體的連接方法一：加同聚尾連接，用3‘末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，使載體與cDNA的3’末端帶上互補(bǔ)的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最后用T4DNA連接酶封口同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法,具有很多優(yōu)點(diǎn):①首先不易自身環(huán)化,這是因?yàn)橥环NDNA的兩端的尾巴是相同的,所以不存在自身環(huán)化②因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的粘性末端,所以連接效率較高③用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進(jìn)行連接,所以是一種通用的體外重組的方法。cDNA片段與載體的連接方法二：加人工接頭連接，用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點(diǎn)的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭后，用該種限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能也帶有同樣的限制酶切點(diǎn)，為了保護(hù)cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點(diǎn)CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-5將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑；或轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將重組DNA或其他外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，常用的方法有轉(zhuǎn)化（transformation）感染（infection）和轉(zhuǎn)染（transfection）（一）轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或其他外源DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過(guò)程。轉(zhuǎn)化常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。大腸桿菌懸浮在CaCl2溶液中，并置于低溫（0～5℃）環(huán)境下一段時(shí)間，鈣離子使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取

（二）感染（infection）

λ噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖。由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。例：λ噬菌體的生活史

（三）轉(zhuǎn)染（transfection）

轉(zhuǎn)染是指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程常用的方法有電穿孔法（electroporation）、CaPO4沉淀法、脂質(zhì)體融合法等。進(jìn)入細(xì)胞的DNA可以被整合至宿主細(xì)胞的基因組中，也可以在染色體外存在和表達(dá)。上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞6cDNA文庫(kù)的鑒定根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測(cè)定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。7目的cDNA克隆的分離和鑒定從cD