水產養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測定+液相色譜串聯質譜法

PAGE5水產養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測定液相色譜-串聯質譜法1范圍本文件規(guī)定了水產養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的液相色譜-串聯質譜測定方法。本文件適用于我省水產養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB17378.5海洋監(jiān)測規(guī)范第5部分：沉積物分析HJ494水質采樣技術指導SL187水質采樣技術規(guī)程3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4方法原理水體試樣經過濾，底泥試料經氨化乙酸乙酯提取，氮氣濃縮。所得樣液加入甲酸酸化，固相萃取柱富集凈化，液相色譜串聯質譜儀測定，內標法定量。5試劑與材料5.1試劑除特殊注明外，所用試劑均為分析純，實驗用水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.2乙酸乙酯：色譜純。5.1.3甲酸（HCOOH）：色譜純。5.1.4氨水（NH3?H2O）：分析純。5.2溶液配制5.2.11%氨水-乙酸乙酯：取5mL氨水（5.1.4）加入495mL乙酸乙酯中，混合均勻，備用。5.2.21%甲酸-水溶液：取10mL甲酸（5.1.3）加入990mL水中，混合均勻，備用。5.2.35%氨水-乙腈溶液：取25mL氨水（5.1.4）加入475mL乙腈（5.1.1）中，混合均勻，備用。5.2.4流動相（0.1%甲酸-水溶液）：取1mL甲酸（5.1.3）加入1000mL水中，混合均勻，備用。5.3標準品5.3.1地西泮（Diazepam，C16H13ClN2O，CAS號：439-14-5），純度≥99.9%。氘代地西泮（Diazepam-d5，C16H8D5ClN2O，CAS號：65854-76-4），純度≥99.9%。5.4標準溶液配制5.4.1標準儲備液（0.10mg/mL）：取10mg地西泮（5.3.1）標準品，用乙腈（5.1.1）溶解并稀釋定容至100mL，配制成濃度均為0.10mg/mL的標準儲備液。-18℃避光保存，有效期12個月。5.4.2內標儲備液（0.10mg/mL）：稱取10mg氘代地西泮（5.3.2）標準品，用乙腈（5.1.1）溶解并稀釋定容至100mL，配制成濃度均為0.10mg/mL的標準儲備液。-18℃避光保存，有效期12個月。標準中間液（1.0μg/mL）：準確移取地西泮標準儲備液（5.4.1）1mL，于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0μg/mL的標準中間液。-18℃避光保存，有效期6個月。5.4.4內標中間液（1.0μg/mL）：準確移取氘代地西泮標準儲備液（5.4.2）1mL，于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0μg/mL的內標中間液。-18℃避光保存，有效期6個月。5.4.5標準使用液（0.10μg/mL）：準確移取5.00mL地西泮標準中間液（5.4.3）于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為0.10μg/mL的標準使用液。于4℃下避光保存，有效期1個月。5.4.6內標使用液（0.10μg/mL）：準確移取5.00mL氘代地西泮內標中間液（5.4.4）于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為0.10μg/mL的內標使用液。于4℃下避光保存，有效期1個月。5.5材料5.5.1混合型強陽離子交換（MCX）固相萃取小柱：150mg/6mL，或者相當者。5.5.2微孔濾膜:0.22μm聚四氟乙烯濾膜。5.5.3玻璃纖維濾紙（GF/F）：孔徑0.45μm。6儀器與設備6.1液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3冷凍干燥機。6.4渦旋混合器。6.5高速離心機。6.6超聲波清洗器。6.7固相萃取裝置，帶真空泵。6.8氮吹儀。7樣品7.1樣品采集水樣按SL187規(guī)定的方法進行采集。底泥樣品按HJ494規(guī)定的方法進行采集。7.2試樣的制備采集的水樣經玻璃纖維濾紙（）過濾后，置于樣品瓶中，在0℃～4℃避光保存。采集的底泥樣品經冷凍干燥機冷凍干燥后，剔除石塊和植物體等異物，用研缽研磨后過60目（孔徑0.25mm）網篩，在0℃～4℃避光保存。7.3空白試樣的制備選取不含地西泮的同類樣品，按照與試樣制備（7.2）相同的步驟進行空白試樣的制備。8測定步驟8.1提取8.1.1水體準確移取100mL水樣置于離心管中，加入100μL內標使用液（5.4.6），加入1.0mL甲酸（5.1.3）調節(jié)pH，旋渦震蕩，充分混合，8000r/min離心5min，待凈化。8.1.2底泥稱取5g（準確至±0.02g）底泥樣品于50mL離心管中，加水3mL水潤濕，加入100μL混合內標使用液（5.4.6），加入15mL1%氨水-乙酸乙酯（5.2.1）渦旋混合2min，超聲提取10min，8000r/min離心5min，取上清液轉移至25mL比色管中，殘渣用10mL1%氨水-乙酸乙酯（5.2.1）重復提取一次，合并提取液，45℃氮氣吹干，加入5mL乙腈（）溶解，加入250μL甲酸（5.1.3）渦旋混合，待凈化。8.2凈化MCX固相萃取小柱（5.5.1）依次用3mL乙腈（5.1.1）和3mL1%甲酸水溶液（5.2.2）活化。預處理水體和底泥提取試樣全部轉移過柱，控制流速不超過1.0mL/min。待水樣全部通過小柱后，用3mL1%甲酸水溶液（5.2.2）和3mL乙腈（5.1.1）淋洗，減壓抽干，用3mL5%氨水乙腈溶液（5.2.3）洗脫。收集洗脫液，洗脫液45℃氮氣吹干。加入1mL乙腈（5.1.1）溶解殘渣，過0.22μm微孔濾膜（5.5.2），供液相色譜串聯質譜儀（6.1）測定。8.3底泥含水率測定稱取5g底泥樣品，按照GB17378.5中規(guī)定的方法進行含水率測定。8.4標準曲線的制備8.4.1水體分別移取標準使用液（5.4.5）和內標使用液（5.4.6），用乙腈（5.1.1）配制成地西泮的質量濃度為0.20μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、5.00μg/L、10μg/L、50μg/L，氘代地西泮質量濃度為10.0μg/L的系列標準工作液，供液相色譜-串聯質譜測定。以測得特征離子質量色譜峰峰面積為縱坐標、對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程和相關系數。8.5測定8.5.1液相色譜參考條件色譜柱：C18（100×2.1mm，粒徑2.6μm），或相當者；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸-水溶液。梯度洗脫條件見表1；進樣量：5μL；流速：0.30mL/min；柱溫：40℃。表1流動相梯度洗脫條件時間（min）A（%）B（%）010900.510904.09556.09556.110908.510908.5.2質譜參考條件a）離子源：電噴霧離子源；b）掃描方式：正離子掃描；c）檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；d）噴霧電壓：5.5kV；e）脫溶劑氣溫度：550℃；f）多反應監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表2。表2多反應監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量化合物名稱母離子m/z子離子m/z去簇電壓V碰撞能量eV地西泮285.1222.1a10044154.110040氘代地西泮290.1154.110040a為定量離子。8.5.3定性測定在相同測試條件下，試樣中待測物的保留時間與標準工作液中待測物的保留時間一致，偏差在±2.5%以內，且試樣中待測物定性離子的相對豐度與濃度相當的標準溶液對應的定性離子的相對豐度一致。其允許偏差應符合表3的要求。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%～50%>10%～20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%8.5.4定量測定按8.5.1和8.5.2設定儀器條件，取標準工作溶液、試樣溶液、空白試樣溶液等體積進樣測定，內標法定量。標準工作溶液和試樣溶液中目標物的響應值均應在儀器檢測線性范圍內。上述液相色譜-質譜條件下，地西泮標準溶液特征離子質量色譜圖見附錄A。8.6空白實驗按照與上述測定步驟相同的條件進行空白試樣（7.3）的測定。9結果計算和表述水體中待測物含量按式（1）計算。計算結果須扣除空白值，保留兩位有效數字?！?）式中：X1——試樣中待測物的含量，單位為微克每升（μg/L）；Ci——從標準工作曲線得到的待測物溶液濃度，單位為微克每升（μg/L）；V——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；V0——試樣體積，單位為毫升（mL）。底泥中待測物含量按式（2）計算。計算結果須扣除空白值，保留兩位有效數字。…………（2）式中：X2——試樣中待測物的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；V1——試樣提取液體積，單位為毫升（mL）。V2——準確移取的備用液體積，單位為毫升（mL）。m——試樣質量，單位為克（g）。w——試樣含水率，單位為質量分數（%）。10檢測方法的靈敏度、準確度和精密度10.1靈敏度本方法在水產養(yǎng)殖環(huán)境水體中地西泮的檢出限均為0.002μg/L，定量限均為0.005μg/L；在水產養(yǎng)殖環(huán)境底泥中地西泮的檢出限均為0.05μg/kg，定量限均為0.1μg/kg。