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文檔簡介

實(shí)驗(yàn)三酶促轉(zhuǎn)氨反應(yīng)一實(shí)驗(yàn)原理

氨基酸分子上的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮酸分子上的反應(yīng)稱轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。由轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是氨基酸代謝的重要反應(yīng)之一。經(jīng)轉(zhuǎn)氨后，原來的氨基酸變成了酮酸，而原來的酮酸則變成新的氨基酸。

在動(dòng)物機(jī)體中活力最強(qiáng)、分布最廣的轉(zhuǎn)氨酶有兩種：一種為谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱GPT），另一種為谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱GOT）。它們的催化反應(yīng)如下：

GPT丙氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸此反應(yīng)最終產(chǎn)物都是丙酮酸。測定單位時(shí)間內(nèi)丙酮酸的產(chǎn)量即可得知轉(zhuǎn)氨酶的活性。

丙酮酸可與2,4

–

二硝基苯肼反應(yīng)，形成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色。再與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，計(jì)算出其含量，以此測定轉(zhuǎn)氨酶的活性。

丙酮酸

+

2,4

–

二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙（棕紅色）

1.稱取0.3g葉片——用剪刀將葉片剪碎——放于研缽中。2.量取4ml磷酸緩沖液，分三次加入研缽中（2，1，1），研磨成漿狀，到入離心管中，5000rpm離心10min,

上清液即為酶粗提液。二實(shí)驗(yàn)步驟3.取4支試管——編號(hào)——按下表要求加樣:試管號(hào)1(空白管)2(對(duì)照管)3(標(biāo)準(zhǔn)管)4(樣品管)酶粗提液（ml）0.10.1Ala和α-酮戊二酸(ml)0.5標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸液(ml)0.5磷酸緩沖液(ml)0.60.50.14.加樣完畢搖勻用橡皮筋將4支試管扎牢置于40℃水浴中加熱30min。5.取出冷卻

每支試管各加0.5ml2，4-二硝基苯肼反應(yīng)5min再每支試管各加5ml0.4N的NaOH溶液

搖勻

靜止10min在λ=530nm下，測量吸光度OD值。三、計(jì)算：按下式計(jì)算丙酮酸生成量：Cx=樣品中丙酮酸含量

Cs=標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液含量(0.002mM/ml)V=標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶

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