DB51T 1098-2010 牛奶中磺胺二甲氧嘧啶殘留檢測方法-酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法　　

DB51/T1098—2010牛奶中磺胺二甲氧嘧啶殘留檢測方法一四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB51/T1908—2010前言 錯(cuò)誤!未定義書簽。 12規(guī)范性引用文件 1 14測定方法 15測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 3本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省獸藥監(jiān)察所、四川省獸藥殘留監(jiān)控中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳曉嵐、程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艷麗、王海波。11范圍凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。3制樣3.2樣品的保存4測定方法4.2試劑和材料4.2.1十二水合磷酸氫二鈉(Na?HPO4.12H?O),二水合磷酸二氫鉀(KH?PO4.2H?O),氯化鈉(NaC1),氯化鉀(KC1)。4.2.20.02MPBS緩沖液稱取5.36g十二水合磷酸氫二鈉、0.20g二水合磷酸二氫鉀、8.00g氯化鈉和0.20g氯化鉀加去離子水溶液定容至1L。4.2.3磺胺二甲氧嘧啶試劑盒：2℃~8℃保存。(采用官方備案的試劑盒)4.2.3.196孔板酶標(biāo)板8條×12孔：包被有磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原。4.2.3.5底物溶液A。4.2.3.6底物溶液B。24.2.3.7濃縮洗滌液臨用前用水稀釋二十倍作為洗滌液。4.2.3.8濃縮復(fù)溶液臨用前用水1:1稀釋。4.2.3.9終止溶液。4.3儀器和設(shè)備4.3.1酶標(biāo)儀(配備450nm濾光片)。4.3.3分析天平感量0.0001g。4.3.4漩渦混合器。4.3.5氮吹儀。4.3.6冷凍離心機(jī)。4.3.7振蕩器。4.3.9微量移液器單道50μL,100μL,1000μL多道50μL-250μL。4.4測定步驟4.4.1試料的制備試料的制備包括：——取制備后的供試樣品，作為供試試料?！≈苽浜蟮目瞻讟悠罚鳛榭瞻自嚵?。——取制備后空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試料。取制備后的試樣5.0mL于離心管中，3000r/min,10℃離心10min,吸除上層脂肪；取1ml離心后的緩沖液(見配液3)按1:19的體積比進(jìn)行稀釋(即20μl牛奶+380μ10.02MPBS緩沖液);最后取20μl用于分析。4.4.3樣品測定程序(20℃~26℃條件下操作)4.4.3.1使用前將試劑盒置于室溫(20℃~26℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2℃~8℃。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。4.4.3.2加入50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液到微孔底部，隨即加入酶標(biāo)二抗50μ1/孔，再加入抗體工作液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃溫箱中避光反應(yīng)60min。4.4.3.3加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B到微孔中，輕輕振蕩混勻25℃避光環(huán)境顯色30min。4.4.3.4加入50μL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定每孔吸光度值(OD4.5結(jié)果計(jì)算和表述所獲得的標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))吸光度值的平均值再乘以100%,得到以百分比給出的吸光度值，以式(1.1)表示：式中：B—為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值；Bo—為零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以X軸為標(biāo)準(zhǔn)溶液中磺胺二甲氧嘧啶濃度(μg/L)的自然對數(shù)，Y軸為百分吸光度值，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)的供試樣品的濃度(μg/L)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。也可以求出回歸曲3DB51/T1908—2010線的方程，計(jì)算未知樣品中磺胺二甲氧嘧啶的濃度。如果有專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件可直接求出供試樣中磺胺二甲氧嘧啶的濃度。注：檢測結(jié)果小于20.0μg/L時(shí)，可判為未檢出，大于20.0μg/L時(shí)，判為可疑，需用確證法確認(rèn)。本方法在牛奶中磺胺二甲氧嘧啶的最低檢測限為