第六章-食品與細(xì)胞工程

FoodBiotechnology食品生物技術(shù)1目錄第一章緒論第二章食品與基因工程第三章食品與蛋白質(zhì)工程第四章食品與酶工程第五章食品與發(fā)酵工程第六章食品與細(xì)胞工程第七章食品生物工程中的下游過(guò)程第八章食品生物技術(shù)與食品安全檢測(cè)第九章生物技術(shù)與食品工業(yè)“三廢”治理2第六章食品與細(xì)胞工程第一節(jié)概述第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用第四節(jié)細(xì)胞拆合及其應(yīng)用第五節(jié)動(dòng)、植物細(xì)胞大量培養(yǎng)及應(yīng)用3第一節(jié)概述細(xì)胞工程（cellengineering）是生物技術(shù)的重要組成部分，它是以生物細(xì)胞或組織為研究對(duì)象，按照預(yù)定目標(biāo)和設(shè)計(jì)有計(jì)劃地改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì)并使之增殖，從而生產(chǎn)有用的細(xì)胞生物產(chǎn)品或獲得新型生物品種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。一、細(xì)胞工程的定義4從研究水平而言，細(xì)胞工程研究層次可分為細(xì)胞水平、組織水平、細(xì)胞器水平和基因水平。細(xì)胞工程研究?jī)?nèi)容包括：細(xì)胞大量培養(yǎng)及控制生長(zhǎng)技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞拆合技術(shù)、染色體導(dǎo)入技術(shù)、胚胎和細(xì)胞核移植技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。細(xì)胞工程的核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖目的：獲得新性狀、新個(gè)體、新物質(zhì)5

二、細(xì)胞工程的發(fā)展61動(dòng)物細(xì)胞工程的發(fā)展78910112植物細(xì)胞工程的發(fā)展12131415161718192021三、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)22細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立胚胎學(xué)的發(fā)展分子生物學(xué)的發(fā)展2324組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)這一名詞實(shí)際上是一個(gè)通用名詞，習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個(gè)不同概念：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。25A：細(xì)胞培養(yǎng)：將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個(gè)細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長(zhǎng)，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細(xì)胞培養(yǎng)。26B：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動(dòng)生長(zhǎng)的過(guò)程稱為組織培養(yǎng)。從組織塊中生長(zhǎng)出來(lái)的仍然是細(xì)胞，細(xì)胞在生長(zhǎng)的同時(shí)也發(fā)生移動(dòng)，至使組織培養(yǎng)難以長(zhǎng)時(shí)間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細(xì)胞培養(yǎng)。27C：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官在體外存活、生長(zhǎng)，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。28體外培養(yǎng)的種類29

生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生物技術(shù)產(chǎn)品如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長(zhǎng)因子及干擾素、白細(xì)胞介素等生長(zhǎng)因子及單克隆抗體等?？茖W(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等。1、細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實(shí)意義30

1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控、檢測(cè)甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。

2、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)31

2.

研究條件可以人為控制

可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，同時(shí)，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。323.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性

通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時(shí)，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。334.研究?jī)?nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄

采用各種研究技術(shù)、記錄方法：

研究:倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記--

記錄:攝影照片、縮時(shí)電影、電視--345.研究的范圍比較廣泛

學(xué)科多：細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等

對(duì)象廣：

各種動(dòng)物：低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類

一種動(dòng)物：不同年齡--

不同組織--

正?；虍惓＃[瘤--）

356.研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì)

可提供大量、同一時(shí)期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。36

現(xiàn)人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,

但,人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況

仍不完全相同.

當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,

生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中,

久了，必然發(fā)生變化.3、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)37

因此，對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動(dòng)物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。38有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準(zhǔn)確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無(wú)章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放。4、細(xì)胞培養(yǎng)的工作原則39第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）是指動(dòng)、植物細(xì)胞在體外條件下生長(zhǎng)、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過(guò)程中不再形成組織的一項(xiàng)技術(shù)。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史，早在20世紀(jì)40年代J.Bonner就報(bào)道了銀膠菊（Parthenium

hysterophorus）植物組織培養(yǎng)能產(chǎn)生橡膠。20世紀(jì)70年代，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)一些藥用有效成分在工業(yè)上獲得了成功。401984年日本的Mitsui石化公司利用紫草的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧，規(guī)模達(dá)到750L，產(chǎn)物最終濃度達(dá)到1400mg/L。在我國(guó)，對(duì)于人參中人參皂苷的生物合成研究較為深入。至今，利用植物細(xì)胞工程進(jìn)行天然產(chǎn)物的生產(chǎn)進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段。41離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過(guò)程稱為植物細(xì)胞的再分化。二、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程4243（二）植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)1958年Steward和Shantz

培養(yǎng)了來(lái)自胡蘿卜根韌皮部的細(xì)胞，并成功地經(jīng)液體振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)單個(gè)的懸浮細(xì)胞發(fā)育為成熟的胚胎，并得到了完整的小植株，最終開(kāi)花結(jié)果。首次證明了Haberlandt提出的細(xì)胞全能學(xué)說(shuō)（三）培養(yǎng)基目前，已經(jīng)研制了多種適宜各種植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、White、Heller、ER、Nitsch、NT等，最常用的是MS培養(yǎng)基，目前Sigma等試劑公司已將基本培養(yǎng)基MS商品化。44（四）愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、愈傷組織和懸浮細(xì)胞的制備，愈傷組織是從外植體的離體材料組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞，誘導(dǎo)愈傷組織的外植體可以采自植物的不同器官，幼嫩的根、莖、葉、花或果實(shí)都是誘導(dǎo)愈傷組織的好材料，在有些植物上較老的器官和組織也有產(chǎn)生愈傷組織的能力。2、高表達(dá)細(xì)胞系的篩選建立為了獲得適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)用的細(xì)胞株，高產(chǎn)細(xì)胞系的建立與種質(zhì)保存技術(shù)如圖6-1所示。45圖6-1高產(chǎn)細(xì)胞系的建立與種質(zhì)保存的技術(shù)方案46（五）單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、單細(xì)胞分離方法（1）機(jī)械法，分離葉肉組織的方法：將葉片輕輕研碎，經(jīng)過(guò)濾和離心，收集和凈化細(xì)胞。（2）酶法，單細(xì)胞分離的酶法指利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他外植體，使細(xì)胞分離的方法。

（3）化學(xué)法，單細(xì)胞分離的化學(xué)法指利用一些化學(xué)藥劑游離細(xì)胞的方法。472、單細(xì)胞培養(yǎng)方法（1）看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（nursingculture）是用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。（圖6-2）看護(hù)培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，效果好。圖6-2看護(hù)培養(yǎng)程序示意圖（2）平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)（plantingculture）法的具體操作是將一定細(xì)胞密度（通常為l03~l05個(gè)細(xì)胞/mL）制備好單細(xì)胞懸浮液，接種到瓊脂培養(yǎng)基上并鋪成約1mm左右的薄層固體平板進(jìn)行培養(yǎng)。

48（3）微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)（microculture）是在人工制造的無(wú)菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法，見(jiàn)圖6-3。圖6-3微室培養(yǎng)示意圖493、單細(xì)胞培養(yǎng)的程序，見(jiàn)圖6-4所示圖6-4單細(xì)胞培養(yǎng)程序示意圖（引自周微燕，2001）50（六）提高植物細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的方法1、加入前體物或誘導(dǎo)物前體物質(zhì)往往是次生代謝合成途徑中的某一中間化合物或是合成的起始物，誘導(dǎo)物（elicitor）是一類能引起植物細(xì)胞代謝強(qiáng)度改變或代謝途徑改變的物質(zhì)。2、毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)技術(shù)毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)（見(jiàn)圖6-5）。51圖6-5由植物器官培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物工藝流程圖52二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞并離散，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在體外無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)起源于19世紀(jì)所應(yīng)用的某些胚胎學(xué)技術(shù)。531997年英國(guó)Wilmut領(lǐng)導(dǎo)的小組用體細(xì)胞克隆技術(shù)克隆出“多利”（Dolly）綿羊。2001年英國(guó)又宣布成功培育出世界首批轉(zhuǎn)基因克隆豬。我國(guó)在細(xì)胞工程一些重要領(lǐng)域的也已經(jīng)進(jìn)入世界先進(jìn)行列，如轉(zhuǎn)基因魚(yú)、試管嬰兒、動(dòng)物體細(xì)胞克隆等。20世紀(jì)80年代以后，隨著細(xì)胞生物學(xué)、培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法等領(lǐng)域的不斷豐富和完善。54

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

55動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程

幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)56（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般程序是：從組織取得材料切碎、酶處理、單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（原代培養(yǎng)）和擴(kuò)大培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)）。體外培養(yǎng)的細(xì)胞根據(jù)是否貼附于支持物上生長(zhǎng)的特性，主要可分為兩大類：懸浮型細(xì)胞（suspensioncell）和貼附型細(xì)胞（adherentcell）。57按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，主要有四種類型（見(jiàn)圖6-6）：①成纖維細(xì)胞型細(xì)胞，②上皮細(xì)胞型細(xì)胞，③游走細(xì)胞型細(xì)胞，④多形性細(xì)胞型細(xì)胞圖6-6動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)（a）成纖維細(xì)胞型；（b）上皮細(xì)胞型；（c）游走細(xì)胞型；（d）多形性細(xì)胞型（引自鄂征，1995）58（二）、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線（gowthcurve）一般分為潛伏期（lagphase）、指數(shù)生長(zhǎng)期（logphase）、平臺(tái)期（plateauphase）和衰退期（senescencephase）四個(gè)時(shí)期（圖6-7）。59圖6-7每代細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程示意圖60（三）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1、無(wú)菌條件2、溫度3、pH與CO2濃度4、營(yíng)養(yǎng)物，培養(yǎng)液的成分要包含滿足細(xì)胞進(jìn)行糖代謝、脂代謝及核酸代謝所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，如多種必需氨基酸及非必需氨基酸、碳水化合物、維生素、輔酶、核酸、嘌呤、激素、生長(zhǎng)因子及無(wú)機(jī)鹽等。用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基一般可分為天然、合成、無(wú)血清培養(yǎng)基幾種。目前研制的無(wú)血清培養(yǎng)基一般是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子以及激素、基質(zhì)組成。5、緩沖體系，目前最常用的BSS液是Hanks液、Earle液和PBS液等。61植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動(dòng)物血清植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系快速繁殖、培育無(wú)病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白62第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用細(xì)胞融合（cellfusion），或稱為細(xì)胞雜交（cellhybrization）是指在外力（自然或人工）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體互相接觸，不經(jīng)過(guò)有性過(guò)程而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成一個(gè)雜合細(xì)胞的現(xiàn)象。63一、細(xì)胞融合的方法（一）病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合這是最早采用的誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法。最常用的是副黏液病毒類，如腮腺炎病毒、新城子雞瘟病毒、仙臺(tái)病毒和SV5病毒，在這些病毒中的仙臺(tái)病毒是最為廣泛使用的。64PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的過(guò)程大致如下：雙親本細(xì)胞→分別制成細(xì)胞懸液→混合離心→棄上清→雙親細(xì)胞沉淀→加入PEG，水?。?7℃，60s振搖）→細(xì)胞凝集、融合→加入37℃無(wú)血清培養(yǎng)液，終止作用→離心，棄上清，洗滌細(xì)胞→選擇性培養(yǎng)基（二）化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合化學(xué)融合（chemicalfusion）是指利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。

65（三）物理誘導(dǎo)細(xì)胞融合1、電誘導(dǎo)細(xì)胞融合（cellelectrofusion）如圖6-8所示。若選擇的電壓強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間恰當(dāng)，則全部細(xì)胞或原生質(zhì)體都會(huì)融合。圖6-8電融合誘導(dǎo)法原理示意圖（羅立新細(xì)胞融合技術(shù)與應(yīng)用，2003）66其整個(gè)過(guò)程如圖6-9所示。圖6-9電融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合示意圖（http：///emgzf/eppendorf_bionews3/Page6.pdf）2、細(xì)胞融合激光誘導(dǎo)法（laserinducedcellfusion）

3、離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合法（ionsinducedcellfusion）67二、植物細(xì)胞融合（一）原生質(zhì)體

原生質(zhì)體指用特殊方法脫去植物細(xì)胞壁后而成裸露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。

植物細(xì)胞的原生質(zhì)體可以從培養(yǎng)的單細(xì)胞、愈傷組織和植物器官（種子根、子葉、下胚軸、胚細(xì)胞、花粉細(xì)胞和嫩葉等）獲得。最常用的理想的材料還是植物的葉片。68（二）原生質(zhì)體的制備1、原生質(zhì)體的分離（1）材料的消毒處理（2）植物細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法A、機(jī)械分離法B、酶解分離法常用的細(xì)胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、R-10、蝸牛酶等。其中纖維素酶類包括纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶。原生質(zhì)體制備程序如圖6-10所示。692、原生質(zhì)體的純化（1）過(guò)濾-離心法（2）漂浮法（3）沉降法和漂浮法結(jié)合（三）植物細(xì)胞融合植物細(xì)胞的融合采用PEG法和電融合法比較適用。（四）植物融合子的鑒定70第四節(jié)細(xì)胞拆合及其應(yīng)用一、細(xì)胞拆合與重組的涵義細(xì)胞重組（cellreconstruction）是細(xì)胞工程中將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核、質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合，即在融合介于誘導(dǎo)下，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，重新構(gòu)成胞質(zhì)雜種細(xì)胞的過(guò)程。71所謂細(xì)胞拆合，在細(xì)胞工程中主要指核質(zhì)拆合技術(shù)，即用特殊的方法使完整活細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，或把細(xì)胞核從細(xì)胞質(zhì)中吸取出來(lái)，或用紫外線等把細(xì)胞中的核殺死，然后在體外一定條件下將同種或異種的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)重新組合起來(lái)，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞，培育出特定形狀和功能的細(xì)胞或新的個(gè)體。72細(xì)胞重組的方式：（1）胞質(zhì)體與完整細(xì)胞重組形成細(xì)胞質(zhì)雜交細(xì)胞；（2）微細(xì)胞與完整細(xì)胞重組形成微細(xì)胞異核體；（3）胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞。即將除去細(xì)胞核后的胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞。這種細(xì)胞重組的技術(shù)即核移植技術(shù)。73核移植技術(shù)，它是利用顯微鏡操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而創(chuàng)造無(wú)性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。細(xì)胞拆合技術(shù)中最具有重要意義的是動(dòng)物細(xì)胞核移植工作，我國(guó)在魚(yú)類細(xì)胞核移植方面的研究處于世界先進(jìn)水平。74二、細(xì)胞拆合的方法細(xì)胞拆合技術(shù)?？煞譃槲锢聿鸷戏ê突瘜W(xué)拆合法。（一）物理拆合法物理拆合法是用機(jī)械的方法或短波光將細(xì)胞核去掉（見(jiàn)圖6-11）。75A.去核吸管接近透明帶B.去核吸管插入透明帶并探推卵質(zhì)膜C.將極體、中期染色體及其周圍胞質(zhì)吸入去核吸管D.退出去核吸管圖6-11核移植受體成熟卵去核過(guò)程示意圖（王蒂，細(xì)胞工程學(xué)，2003）76（二）化學(xué)拆合法細(xì)胞松弛素（cytochalasin）最早是從霉菌（Helminthosporium

dematioideum）代謝產(chǎn)物中得到的化合物，具有多種不同的結(jié)構(gòu)，目前已分離純化出A、B、C、D、E、F、G、H等幾種，迄今有關(guān)研究大多使用細(xì)胞松弛素B（CB），即C29H37NO5。CB對(duì)于活細(xì)胞具有不尋常的特殊效應(yīng)，它能阻斷細(xì)胞質(zhì)分裂而不干擾細(xì)胞核的分裂，引起細(xì)胞表面形狀的改變，目前常用CB結(jié)合離心技術(shù)，可將細(xì)胞拆分為核體和胞質(zhì)體，一次處理可得到許多胞質(zhì)體。77三、各種重組細(xì)胞的制備（一）胞質(zhì)體和核體的制備與融合，圖6~12表示離心脫核法。在使用核體進(jìn)行融合前，可利用核體貼壁粘附性弱的特點(diǎn)，用離心的方法分離純化核體。（見(jiàn)圖6-13）圖6-12離心脫核法圖6-13胞質(zhì)體和核體的制備過(guò)程示意圖（羅立新，細(xì)胞工程，2003）78

（二）微細(xì)胞的制備與融合當(dāng)核膜重新形成分別包封一對(duì)或幾對(duì)染色體時(shí)，細(xì)胞內(nèi)便許多大小不一的被完整核膜包裹的微核體（micronucleus），用CB結(jié)合離心術(shù)進(jìn)行脫核，可分離出大小不同的微細(xì)胞（microcell）。79（三）細(xì)胞核移植核移植是指利用物理、機(jī)械或化學(xué)方法將一種細(xì)胞的核取出細(xì)胞，經(jīng)分離純化后，移植到另一種細(xì)胞的已去除核的胞質(zhì)體中，20世紀(jì)30年代德國(guó)胚胎學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)獲得者spemnnn首次提出“核移植”的設(shè)想：能否將細(xì)胞核移植到成熟的去核卵母細(xì)胞中進(jìn)行個(gè)體復(fù)制，以獲得遺傳性狀與供體細(xì)胞一致的后代，但由于技術(shù)方面的原因他沒(méi)能找到將細(xì)胞核導(dǎo)入卵細(xì)胞的方法。哺乳動(dòng)物核移植的過(guò)程示意圖見(jiàn)圖6-14。圖6-14細(xì)胞核移植過(guò)程示意圖1切開(kāi)卵母細(xì)胞透明帶2擠出卵母細(xì)胞細(xì)胞核3注入供體細(xì)胞核4電融合儀融合5培養(yǎng)80細(xì)胞器移植技術(shù)277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。81卵細(xì)胞C母綿羊子宮Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵細(xì)胞細(xì)胞拆合技術(shù)妊娠多莉羊的培育過(guò)程無(wú)性生殖82克隆羊的成功證明了什么？1、動(dòng)物體細(xì)胞核具有全能性；2、細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的作用。83預(yù)想的克隆人技術(shù)路線84第五節(jié)動(dòng)、植物細(xì)胞大量培養(yǎng)及應(yīng)用一、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及在食品工業(yè)中的應(yīng)用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)物有種苗、細(xì)胞、初級(jí)代謝物、次級(jí)代謝物和生物大分子等等。植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的應(yīng)用即為次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)。植物體內(nèi)的化合物可以分為初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物兩大類。初生代謝產(chǎn)物包括淀粉、糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸，維生素等，次生代謝產(chǎn)物是一大類無(wú)明顯生理功能或者非生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物。85植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與微生物細(xì)胞發(fā)酵類似，一般流程為：86概念：應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技術(shù)）原理：植物細(xì)胞的全能性優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，可大批量生產(chǎn)取材少培養(yǎng)周期短保持優(yōu)良性狀微型繁殖87細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)紅豆杉與紫杉醇人參皂甘的生產(chǎn)88它有治療癌癥的強(qiáng)大功效。從紅豆杉的樹(shù)皮和樹(shù)葉中提煉出來(lái)的紫杉醇對(duì)多種晚期癌癥療效突出，被稱為“治療癌癥的最后一道防線”。紅豆杉的根、莖，葉、果都是寶，以紅豆杉植株為主要原料提取的紫杉醇，主要用于晚期乳腺癌、晚期卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤和頭頸部腫瘤、上胃腸道癌、小細(xì)胞性和非小細(xì)胞性肺癌的治療。經(jīng)驗(yàn)證明，紫杉醇具有獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制和顯著的抑制腫瘤的作用。89作物脫毒