核酸濃度測(cè)定

核酸的定量與純度的測(cè)定在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，核酸提取需要進(jìn)行其純度和濃度的測(cè)定。目前實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)定方法主要有分光光度法、熒光染料法、PCR法和雜交定量法等。分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA，單鏈DNA濃度約為33μg/ml，RNA約為40μg/ml，寡核苷酸約為35μg/ml。如用1cm光徑，用H2O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當(dāng)于50%蛋白質(zhì)/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。A320nm或A340nm為檢測(cè)溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。假如不足，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。實(shí)驗(yàn)步驟1、將制備的DNA懸浮溶解于TE緩沖液中pH8.0，10mmo1/L的Tris緩沖液，內(nèi)含(1mmol/LEDTA)或懸浮溶解在滅菌水中(依據(jù)DNA含量加水)。2、用可掃描的紫外分光光度計(jì)測(cè)定制備的DNA/RNA的紫外吸收曲線，測(cè)定OD260和OD280，并計(jì)算比值：OD260/OD280，純DNA的此比值約為1.8～2.0。純RNA的此比值約為大于2.0。3、根據(jù)每毫升1微克的純DNA的OD260值=0.020，計(jì)算所得DNA的純度；每毫升1微克的純RNA的OD260值=0.025，計(jì)算所得RNA的純度。注意事項(xiàng)OD值范圍應(yīng)該在0.1～0.99之間，否則不符合上述線性關(guān)系。A260/A280比值可提供DNA純度的一個(gè)參考，但A260/A280比值會(huì)受pH影響。如果未調(diào)pH，比值可能與實(shí)際差別很大。如果需要準(zhǔn)確數(shù)值，建議在10mMTrisCl，pH8.5中檢測(cè)，此時(shí)純凈的DNAA260/A280比值應(yīng)為1.8-2.0（注意應(yīng)使用同樣緩沖液作為對(duì)照）。常見問題分析1、DNA濃度測(cè)定的OD260/OD280比值大于1.8，說明存在RNA，可重新用RNaseA處理，酚：氯仿：異戊醇（23：24：1）抽提；DNA濃度測(cè)定的OD260/OD280比值小于1.8，則說明有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、異戊醇重新對(duì)DNA進(jìn)行純化（也可加入1/8體積的3MNaAc(pH5.2)與冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。RNA濃度測(cè)定OD260/OD280比值小于1.8時(shí)，說明溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯；OD260/OD280比值大于2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。2、采用紫外檢測(cè)法測(cè)核酸含量的優(yōu)缺點(diǎn)：用紫外光吸收法測(cè)定樣品的核酸含量，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，并且待測(cè)核酸樣品中含有的微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)，產(chǎn)生較小測(cè)定誤差。但該法在測(cè)定樣品內(nèi)混雜有大量的上述吸收紫外光物質(zhì)時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生較大測(cè)定誤差，需要設(shè)法事先除去。3、樣品中含有核苷酸類雜質(zhì)：假如樣品中蛋白質(zhì)、核苷酸類物質(zhì)較多可以通過離子層析柱進(jìn)一步提純，再用紫外吸收法測(cè)定。4、樣品體系中其它物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有干擾：蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時(shí)對(duì)核酸的紫外測(cè)定影響不大。RNA在260nm與280nm處的吸收比值在2.0以上，DNA的比值則在1.9左右。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，比值即下降。（2）定糖定磷法定糖定磷法是通過測(cè)定核酸中戊糖和無機(jī)磷含量實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸含量的測(cè)定。該法無需特殊儀器，只需要將地衣酚、二苯胺及鉬酸銨等與核酸樣品反應(yīng)，再通過分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值即可定量核酸。但此法準(zhǔn)確度差、靈敏度低、干擾物多、操作繁瑣，在現(xiàn)今的研究中已較少采用。比如二苯胺法是利用脫氧核糖核酸中的α—脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成ω—羥基—γ酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣的反應(yīng)。1、DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支試管，編號(hào)，以一定的梯度依次加入不同濃度的DNA溶液和二苯胺試劑試劑。加畢，搖勻，于60℃恒溫水浴中保溫1小時(shí)，（或于沸水中煮沸15分鐘，冷卻測(cè)0.D595nm值）。以光密度為縱坐標(biāo)，DNA含量（ug/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定取2支試管，各加0.2-0.5毫升的待測(cè)液（內(nèi)含DNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)范圍之內(nèi)）加蒸餾水稀釋至2毫升，再加4毫升二苯胺試劑，搖勻，其操作步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作相同。根據(jù)測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光密度DNA的含量，按下式計(jì)算出樣品中DNA的百分含量。DNA含量/毫升待測(cè)液=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值×稀釋倍數(shù)注意事項(xiàng)1、二茉胺法測(cè)定DNA含量靈敏度不高，待測(cè)樣品中DNA含量低于50mg/L即難以測(cè)定。乙醛可增加二苯胺法測(cè)定DNA的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯糖的干擾，能顯著提高測(cè)定的靈敏度。2、樣品中含有少量RNA并不影響測(cè)定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應(yīng)形成有色化合物，故能干擾DNA定理。（3）酶催化法基于酶催化的核酸定值方法是一種相對(duì)核酸定量法。其原理是染料能同時(shí)與酶和核酸結(jié)合，通過檢測(cè)酶的催化活性即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的定量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要通過核酸擴(kuò)增，操作方便，使用的儀器簡(jiǎn)單。但該法實(shí)驗(yàn)中，酶的催化活性受多方面影響，難以達(dá)到最佳狀態(tài)，會(huì)使定量結(jié)果出現(xiàn)偏差。熒光染料法熒光染料法是通過檢測(cè)熒光試劑與DNA結(jié)合后的熒光強(qiáng)度變化而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的定量。某些熒光探針試劑本身熒光強(qiáng)度不大，但與DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，如：溴化乙錠在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率很低，但它與DNA結(jié)合后，產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，激發(fā)波長(zhǎng)顯著紅移；又如Hoechst33258是一種雙苯并咪唑熒光染料，可高度特異地與雙鏈DNA非嵌入性結(jié)合，結(jié)合后其熒光率由0.01增至0.6。熒光染料法適用于樣品中DNA或RNA含量較低或含有較多雜質(zhì)的樣品，絕對(duì)靈敏度很高.如利用Hoechst33258可測(cè)定納克級(jí)水平的DNA。PicoGreen及SYBRGreenＩ的檢測(cè)靈敏度較EB和Hoechst33258更高，PicoGreen可檢測(cè)低至0.25-0.5ng的DNA樣品。目前已有許多商品化核酸定量熒光染料，如Invitrogen公司用于測(cè)定雙鏈DNA的PicoGreen、用于測(cè)定單鏈DNA的OliGreen及用于測(cè)定RNA含量的RiboGreen等。含這些染料的核酸定量試劑盒被認(rèn)為是目前對(duì)微量核酸定量較準(zhǔn)確的方法。與紫外分光光度法相比，熒光染料法的應(yīng)用尚不廣泛．它存在以下缺陷：（1）某些熒光染料（如EB等）具有極強(qiáng)的毒性和致誘變性；（2）熒光分析對(duì)環(huán)境因素極為敏感，易受溫度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干擾；（3）該法需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作較復(fù)雜；（4）需專業(yè)的定量試劑盒，價(jià)格昂貴；（5）精確定量需依賴已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前缺乏經(jīng)過精確定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且少數(shù)現(xiàn)今采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（λDNA）的定量方法為紫外分光光度法，這就產(chǎn)生潛在的偏差并使測(cè)量結(jié)果無法溯源到國(guó)際單位制。PCR法（1）PCR電泳法PCR技術(shù)檢測(cè)簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、且擴(kuò)增模式多樣，常見的有套式PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR及終點(diǎn)稀釋法等。套式PCR通過嵌套引物的使用進(jìn)一步增加了標(biāo)準(zhǔn)PCR的特異性和靈敏度。終點(diǎn)稀釋法通過梯度稀釋待檢樣本及分別PCR，直到擴(kuò)增結(jié)果為陰性，依據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算起始靶基因的分子數(shù)。這種分析方法的優(yōu)點(diǎn)是核酸的定量不依賴擴(kuò)增效率，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。但每個(gè)樣品需多次PCR反應(yīng)，工作量大，且需獲得穩(wěn)定的PCR反應(yīng)條件。無論是標(biāo)準(zhǔn)PCR還是改進(jìn)的套式PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR及終點(diǎn)稀釋法，反應(yīng)產(chǎn)物均需進(jìn)行電泳，而電泳圖譜只能通過對(duì)比明亮度達(dá)到相對(duì)定量，其檢測(cè)靈敏度、特異性及定量準(zhǔn)確性均較差，且易受多糖、蛋白等雜質(zhì)及反應(yīng)體系的影響。（2）PCR產(chǎn)物微孔板雜交法PCR產(chǎn)物微孔板雜交法結(jié)合了PCR技術(shù)、核酸雜交技術(shù)及酶聯(lián)免疫技術(shù)，該法具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度高于瓊脂糖凝膠電泳；顯色反應(yīng)類似酶聯(lián)免疫檢測(cè)，特異性強(qiáng)；儀器容易操作，穩(wěn)定性好，數(shù)據(jù)讀取客觀；雜交過程短，可以同時(shí)大量檢測(cè)；可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的定量或相對(duì)定量等。但該法操作步驟較繁瑣，且放射性物質(zhì)對(duì)人體有害。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCRqPCR技術(shù)由Higuchi于1992年提出，其原理是在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)品所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行絕對(duì)定量或通過與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的對(duì)比進(jìn)行相對(duì)定量。qPCR技術(shù)因其既可定性又可定量、靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用，已成為核酸定量的主流技術(shù)，其常用的熒光標(biāo)記物質(zhì)有TaqMan探針、MGB、SYBR、分子信標(biāo)等。大量的科研工作使用qPCR，每年產(chǎn)生大量的文章，但是在樣品質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述等方面尚缺乏共識(shí)，使得各種存疑數(shù)據(jù)得以發(fā)表。（4）數(shù)字PCRdPCR是近年發(fā)展起來的一種可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的PCR技術(shù)。與傳統(tǒng)PCR相比，數(shù)字PCR以大規(guī)模集成流路芯片為基礎(chǔ)，可將樣品分到許許多多個(gè)單獨(dú)的區(qū)域進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果報(bào)告“有”或“無”。最后通過PCR循環(huán)數(shù)推算起始模板含量。因此，樣品即便含有會(huì)產(chǎn)生干擾信號(hào)的雜質(zhì)分子，但由于雜質(zhì)分子不會(huì)發(fā)生PCR放大，其信號(hào)將不會(huì)影響最終檢測(cè)結(jié)果。數(shù)字PCR不僅檢測(cè)靈敏度高（可檢測(cè)單個(gè)DNA分子）、所需樣本量少，且準(zhǔn)確度好（誤差可控制在0.25%以內(nèi)）、無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照，是一種潛在的基因定量標(biāo)準(zhǔn)方法．研究人員已將其應(yīng)用于疾病及轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。但該法的主要缺陷是所使用的儀器和耗材十分昂貴，難以在各實(shí)驗(yàn)室普及?？傊?，靈敏度和特異性均表現(xiàn)優(yōu)秀的PCR技術(shù)檢測(cè)是現(xiàn)今生物樣品中微量核酸檢測(cè)的現(xiàn)成、有效的方法。但是，PCR擴(kuò)增普遍遇到的弊端是管與管之間的擴(kuò)增重復(fù)性較差，即使是在最嚴(yán)格的控制條件下其重復(fù)性仍難以保證。重復(fù)性差的可能原因有儀器性能、反應(yīng)條件、抑制劑的存在、樣品制備差異、核酸純化和模板的降解等。另外，還存在以下缺點(diǎn)：qPCR及dPCR等耗材價(jià)格昂貴，很難普及；由于定量全過程封閉，不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。划?dāng)引物特異性不高時(shí)，可能形成假陽性；RNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)各樣品的誤差太大等。雜交定量法雜交定量法主要包括：Southern雜交、Northern雜交、基因芯片、支鏈信號(hào)放大技術(shù)及Rnase保護(hù)技術(shù)。Southern雜交特異性強(qiáng)，但操作復(fù)雜，靈敏度低。與Southern雜交類似的是用于檢測(cè)RNA的Northern雜交技術(shù)，可用于基因表達(dá)量的比較研究。生物芯片是一種高通量的雜交定量技術(shù)。該技術(shù)以核酸雜交為基礎(chǔ)，將短的寡核苷酸或cDNA序列高密度地固定在固相支持物的表面，然后加入已標(biāo)記的目的序列進(jìn)行雜交，之后檢測(cè)熒光信號(hào)。由于熒光信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)分子的數(shù)目成比例，從而實(shí)現(xiàn)核酸定量檢測(cè)。支鏈信號(hào)放大技術(shù)采用了一種人工合成的、結(jié)構(gòu)如同樹枝的DNA信號(hào)放大探針——分支鏈DNA，其優(yōu)點(diǎn)是：（1）只需將釋放的核酸變性，樣品處理簡(jiǎn)單；（2）不經(jīng)過指數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增過程，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染及PCR抑制因素的影響；（3）可高通量檢測(cè)病原體。但該方法成本較高，且當(dāng)放大倍數(shù)低時(shí)，敏感性較差，檢測(cè)范圍窄，不適用于RNA的低濃度檢測(cè)。RNase保護(hù)技術(shù)由Zinn于1983年首次提出，此法的靈敏度高于Northern雜交，但成本比較高、放射性同位素有致癌