免疫組化技術(shù)-理論篇課件

免疫組織化學(xué)（理論篇）

(immunohistochemistry)4.免疫組化技術(shù)-理論篇免疫組化的標(biāo)記物

酶標(biāo)記膠體金標(biāo)記熒光標(biāo)記放射性標(biāo)記4.免疫組化技術(shù)-理論篇免疫組化的標(biāo)記物

酶標(biāo)記：應(yīng)用最廣泛常用標(biāo)記物：

-辣根過氧化物酶(HRP):染色時(shí)同時(shí)加底物H2O2和供氫體（DAB）或AEC，生成棕色（DAB）或紅色（AEC）HRP+DAB（H2）+H2O2=HRP+2H2O+氧化型DAB呈色-堿性磷酸酶(ALP)：以萘酚As-Ms磷酸鹽為底物，快藍(lán)FB/快紅FR為呈色劑，生成藍(lán)色/紅色沉淀。主要用于內(nèi)源性過氧化物酶多得血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞4.免疫組化技術(shù)-理論篇免疫組化的標(biāo)記物膠體金標(biāo)記：

以膠體金做標(biāo)記物對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定位、定量研究的方法。膠體金是一種特殊的金屬顆粒，呈淡紅至深紅色，可在光鏡下觀察。膠體金顆粒大小不同，電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合免疫電鏡觀察。4.免疫組化技術(shù)-理論篇免疫組化的標(biāo)記物

熒光標(biāo)記:

以熒光素做標(biāo)記物,與其相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)后,形成帶有熒光素的免疫復(fù)合物上,在熒光顯微鏡下觀察抗原抗體反應(yīng)結(jié)合部位,對(duì)組織中的抗原或抗體進(jìn)行定位，定量分析。常用熒光素：異硫氰酸熒光素（FluorescienisocynateFITC）：黃綠色熒光德克薩斯（TexasredTR）：鮮紅色羅丹明（RhodameTRITC）紅色花青5（CyanineCY5):藍(lán)色熒光

4.免疫組化技術(shù)-理論篇免疫組化標(biāo)記物放射性標(biāo)記：

使用放射性同位素作為示蹤物，應(yīng)用放射性自顯影術(shù)對(duì)組織中的抗原進(jìn)行分析。

4.免疫組化技術(shù)-理論篇免疫組化的檢測(cè)系統(tǒng)

過氧化物酶抗過氧化物酶法（PAP）堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）卵白素-生物素復(fù)合物法（ABC）鏈酶卵白素-生物素法（LSAB）抗生物素蛋白鏈菌素-生物素復(fù)合物（SABC）酶標(biāo)聚合物法（LDP）如EnVision法增強(qiáng)聚合物一步法（EPOS）催化信號(hào)放大法（CSA）4.免疫組化技術(shù)-理論篇石蠟切片標(biāo)本的處理：組織離體后盡快固定，切開固定效果好，固定液以10％福爾馬林緩沖液為佳，固定時(shí)間在4h-24h之間，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)影響抗原決定簇的暴露，產(chǎn)生陰性結(jié)果。標(biāo)本的處理時(shí)的注意事項(xiàng)4.免疫組化技術(shù)-理論篇

標(biāo)本的取材厚度以2mm為宜，梯度酒精脫水盡量徹底充分，二甲苯透明時(shí)間不宜長(zhǎng)，1～3h為佳，透明過度會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆。浸蠟應(yīng)選擇低熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟應(yīng)充分。標(biāo)本的處理時(shí)的注意事項(xiàng)4.免疫組化技術(shù)-理論篇

切片通常以3～4um的厚度為宜,太厚易掉片，細(xì)胞重疊，對(duì)細(xì)胞膜陽性結(jié)果觀察不理想。裱片要求達(dá)到無皺折、無氣泡，水溫宜在（48～50℃），玻片用APES或多聚賴氨酸處理，以增強(qiáng)粘附性。80℃烘烤1～2h。標(biāo)本的處理時(shí)的注意事項(xiàng)4.免疫組化技術(shù)-理論篇冰凍切片的處理：

冰凍切片的組織抗原保存好，缺點(diǎn)是不易做出好的冰凍切片，易出現(xiàn)冰晶、細(xì)胞腫脹等現(xiàn)象。通常以5um的厚度為佳，冷風(fēng)吹干后用純丙酮固定2遍,干燥置入4℃冰箱短期保存，－20℃冰箱長(zhǎng)期干燥保存。標(biāo)本的處理時(shí)的注意事項(xiàng)4.免疫組化技術(shù)-理論篇

石蠟切片應(yīng)用3％的新鮮H2O2進(jìn)行封閉，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10min。

內(nèi)源性過氧化物酶的封閉4.免疫組化技術(shù)-理論篇熱抗原修復(fù)的緩沖液有多種不同的修復(fù)液，如

pH6.0檸檬酸緩沖液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修復(fù)液等。堿性

pH修復(fù)液常對(duì)絕大多數(shù)抗體的效果更好。推薦使用：EDTA緩沖液

pH8.0或

Tris-EDTA緩沖液

pH9.0是較好的常規(guī)修復(fù)液，可用于大多數(shù)熱修復(fù)有效的抗體（有選擇性,pH6.0緩沖液對(duì)抗體CD7可能獲得結(jié)果最佳）。4.免疫組化技術(shù)-理論篇PAP筆畫圈時(shí)應(yīng)在組織外圍2mm左右，不宜太靠近組織。滴加抗體時(shí)應(yīng)從外周環(huán)繞，不直接滴加在組織中間