分子生物學技術(shù)孔瑾

分子生物學技術(shù)孔瑾聚合酶鏈式反應(yīng)（PCRPolymeraseChainReaction）

一種人工在體外進行快速DNA片斷擴增的方法。PCR技術(shù)基本原理

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。RAPDSSRRFIPRT-PCRNested-PCRPCRmutagenesis(誘變)RaceGenomicwalkingReversetranscriptase(RT)-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCRNestedPCRFirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterestSP6primerT7primerForwardmutagenicprimerReversemutagenicprimerFirstPCRRemoveprimersDenatureandannealExtendtofulllengthbyDNApolymerase3’3’PCRmutagenesis(誘變)SecondPCRSP6primerT7primerDNAcloning克隆(clone)

一個細胞或個體以無性繁殖的方式產(chǎn)生一群細胞或一群個體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無性繁殖(細胞)系。其動詞含義指，即技術(shù)。

分子克隆(clone,cloned,cloning)

在生物體外用重組技術(shù)將特定基因插入載體分子中.將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價連接，然后引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。

分子克隆Cloningvectors(克隆載體):在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。

E.colicloningvector(circular): plasmids(質(zhì)粒) bacteriophages(landM13)(噬菌體) plasmid-bacteriophagelhybrids(cosmids) (考斯質(zhì)粒,質(zhì)粒和噬菌體雜和體).Yeastcloningvector:yeastartificial chromosomes(YACs，酵母人工染色體) (Linear)限制性內(nèi)切酶連接酶用相同的限制性內(nèi)切酶對插入片段和載體同時酶切。用連接酶將插入和載體連接。將連接產(chǎn)物導入感受態(tài)細胞中。在有抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantplasmid:containinginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantplasmid(containinsert)克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細胞內(nèi)擴增，表達載體不僅使外源基因擴增，還要使其表達。凝膠阻滯電泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)EMSA是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)?；驹淼鞍踪|(zhì)與DNA結(jié)合后將大大增加分子量，在凝膠電泳中，DNA朝正電極移動的距離與其相對分子量的隊數(shù)成正比。沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA移動較快，結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA由于受到阻滯移動較慢。用放射性同位素標記待測DNA片段，然后與提取物溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳后用放射性自顯影技術(shù)可以確定DNA條帶的位置，從而確定它與蛋白質(zhì)是否結(jié)合。DNAboundtotwoproteinsDNA-proteincomplexBareDNAADNAboundwithmorethanoneproteintoformalargercomplex.DNaseIfootprinting(DNaseI足跡法)確認和蛋白質(zhì)互作的DNA序列。AATAAG5’*SequenceladderisrequiredtodeterminetheprecisepositionBindproteinDNase(mild),thenremoveproteinanddenatureDNADNasefootprinting

和蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA不被DNase降解.

電泳，放射性自顯影015[Protein]ThethreelanesrepresentDNAthatwasboundto0,1,and5unitsofprotein.

Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.Thelanewithoneunitshowssome

protection,andthelane

with5unitsshowscompleteprotectioninthemiddle.

Byincludingsequencingladders,wecantellexactlywheretheproteinbound.TCGGAGCAACGCAAACAAACGTGCTTGG酵母雙雜交yeasttwo-hybridsystem很多真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain,BD）和轉(zhuǎn)錄激活域

(activationdomain,AD)BD能和特定的基因的啟動子區(qū)結(jié)合，但不能接獲基因的轉(zhuǎn)錄。AD可以在適當?shù)目臻g激活轉(zhuǎn)錄克隆(clone)一個細胞或個體以無性繁殖的方式產(chǎn)生一群細胞或一群個體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無性繁殖(細胞)系。RemoveprimersRNAonblot凝膠阻滯電泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)酵母單雜交系統(tǒng)很多真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain,BD）和轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD)Recombinantplasmid(containinsert)colicloningvector(circular):DNAcloningcDNA:mRNAhybridFirstround在有抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。Removeprimers每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.酵母雙雜交的原理

運用基因重組技術(shù)將已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的表達載體上，轉(zhuǎn)化酵母后能夠形成融合蛋白（誘餌蛋白）。將已知編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）的DNA分別與待篩選的cDNA文庫中的不同插入片段相連接，在酵母中表達形成融合蛋白（獵物蛋白）。如果誘餌蛋白和獵物蛋白能夠相互作用，AD和BD結(jié)構(gòu)域會被拉近，從而激活報告基因的表達。這是一種研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。酵母雙雜交yeasttwo-hybridsystem酵母單雜交系統(tǒng)順式作用元件基本啟動子報告基因轉(zhuǎn)錄因子AD運用基因重組技術(shù)將特定順式作用元件構(gòu)建到基本啟動子上游，把報告基因連接到基本啟動子下游。將待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母激活域（AD）的融合表達載體轉(zhuǎn)入酵母，如果待測轉(zhuǎn)錄因子能和順式作用元件結(jié)合，就能激活基本啟動子，從而激活報告基因的表達。這是一種研究DNA和蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)。1.GelelectrophoresisseparatesDNAandRNAmoleculesaccordingtosize,shapeandtopologicalpropertiesGelElectrophoresis（凝膠電泳）1.DNAandRNAmoleculesarenegativelycharged,thusmoveinthegelmatrix(膠支持物)towardthepositivepole(正電極).2.LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.ThelargeDNAmoleculesmoveslowerthanthesmallmolecules.3.ThemobilityofcircularDNAmoleculesisaffectedbytheirtopologicalstructures.ThemobilityofthesamemolecularweightDNAmoleculewithdifferentshapesis:supercoiled(超螺旋)>linear(線性)>nickedorrelaxed(缺刻或松散)

DNAgelmobility(DNA在膠上的遷移性)Agarose(瓊脂糖):amuchlessresolvingpowerthanpolyacrylamide,butcanseparateDNAmoleculesofuptotensofkb1kb0.5kb2kb3kb4kbPolyacrylamide

(聚丙稀酰胺):hashighresolvingcapability,andcanresolveDNA/RNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.分子雜交分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性標記的探針與被固定的分子雜交,經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。

類型核酸探針應(yīng)用SouthernDNADNAorRNA基因拷貝數(shù)等NorthernRNADNAorRNARNA大小和表達豐度WesternProtein抗體蛋白的大小和豐度ComparisonofSouthern,NorthernandWesternbolthybridizationSouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis

DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling

6.Hybridization (temperature)

7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)

SouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis

DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling

6.Hybridization (temperature)

7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)

RemoveprimersThelanewithoneunitshowssome

protection,andthelane

with5unitsshowscompleteprotectioninthemiddle.RNA大小和表達豐度DNAblotting/transferandfixationRNADNAonblotDenaturewithalkali -到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。確認和蛋白質(zhì)互作的DNA序列。DNaseIfootprinting(DNaseI足跡法)Signaldetection(X-rayfilmorantibody)運用基因重組技術(shù)將已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的表達載體上，轉(zhuǎn)化酵母后能夠形成融合蛋白（誘餌蛋白）。在有抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。將已知編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）的DNA分別與待篩選的cDNA文庫中的不同插入片段相連接，在酵母中表達形成融合蛋白（獵物蛋白）。LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.DNaseIfootprinting(DNaseI足跡法)在有抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.Recombinantplasmid(containinsert)Recreatedvector(noinsert)酵母雙雜交yeasttwo-hybridsystemRNAonblotDNAboundto凝膠阻滯電泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)