生物學(xué)案：課堂探究DNA重組技術(shù)的基本工具

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精課堂探究探究點(diǎn)一基因工程的工具酶·問題導(dǎo)引·黃金大米，又名“金色大米"，是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將胡蘿卜的有關(guān)基因轉(zhuǎn)入到水稻中,從而育成的籽粒外表為金黃色的轉(zhuǎn)基因大米。因黃金大米富含維生素A，所以經(jīng)常食用能防治人體的維生素A缺乏癥。思考：（1）利用何種酶將胡蘿卜的基因從胡蘿卜的DNA上切割下來？簡述該酶的來源和功能。（2）利用何種酶將胡蘿卜的基因與其他的DNA片段拼接成新的DNA分子？簡述該酶的功能和常用類型。提示：（1）限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶，該酶主要是從原核生物中分離純化出來的，其功能是能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(2）DNA連接酶,該酶的功能是將雙鏈DNA片段“縫合”起來,恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶的常用類型是E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶?！っ麕熅v·1．限制酶的作用（1）具有專一性：一種限制酶只能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并在特定的位點(diǎn)上切割。如EcoRⅠ的識(shí)別序列為GAATTC，切割位點(diǎn)在G與A之間；而SmaⅠ的識(shí)別序列為CCCGGG,切割位點(diǎn)在C與G之間.特別提醒限制酶所識(shí)別序列的特點(diǎn)是:呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱。無論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，如下圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對稱。(2）可用于DNA的切割獲取目的基因和切割載體。(3）酶切方式和結(jié)果。有錯(cuò)位切和平切兩種，錯(cuò)位切產(chǎn)生的是黏性末端，平切產(chǎn)生的是平末端.圖示如下:切割DNA分子時(shí)產(chǎn)生的兩種不同末端（箭頭表示酶的切割位置）2．DNA連接酶（1)作用:將限制酶切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子,如下圖.（2）種類。種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源從大腸桿菌中分離得到從T4噬菌體中分離出來作用只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低作用實(shí)質(zhì)將雙鏈DNA片段“縫合”起來,恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵特別提醒限制酶能識(shí)別特定的核苷酸序列，具有專一性，不同的限制酶所識(shí)別的核苷酸序列不同，所以限制酶具有多種。DNA連接酶不能識(shí)別特定的核苷酸序列,具有2種.3．與DNA分子相關(guān)的酶的比較(1)列表比較。種類作用作用部位參與生理過程或應(yīng)用DNA水解酶能夠?qū)NA水解成四種脫氧核苷酸磷酸二酯鍵DNA水解DNA解旋酶能夠?qū)NA或DNA的某一片段分解成兩條長鏈氫鍵DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶能將單個(gè)的脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成DNA長鏈磷酸二酯鍵DNA復(fù)制限制酶能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊的核苷酸序列磷酸二酯鍵基因工程DNA連接酶通過磷酸二酯鍵將具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的兩個(gè)DNA片段連接起來磷酸二酯鍵基因工程特別提醒①DNA水解酶也稱DNA酶。②五種酶中只有限制酶和DNA連接酶被稱為基因工程的工具酶。(2)上述幾種酶的作用部位圖解。作用于a（磷酸二酯鍵）的酶有限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶；作用于b(氫鍵）的酶有解旋酶?！纠}1】限制酶是一種核酸切割酶,可辨識(shí)并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下圖為四種限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨識(shí)序列，箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位，其中哪兩種限制酶所切割出來的DNA片段末端可以互補(bǔ)黏合？其正確的末端互補(bǔ)序列應(yīng)該為（）A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互補(bǔ)序列為-AATT-B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互補(bǔ)序列為-GATC-C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互補(bǔ)序列為-AATT-D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互補(bǔ)序列為—GATC—解析：A項(xiàng)中BamHⅠ酶切出的末端序列為-GATC—，EcoRⅠ酶切出的末端序列為—AATT-，兩者不互補(bǔ)；B項(xiàng)中HindⅢ酶切出的末端序列為—AGCT-，與BamHⅠ酶切出的末端序列不互補(bǔ);同理可推出C項(xiàng)中兩種酶切割出來的末端也不互補(bǔ),只有D項(xiàng)中才互補(bǔ)。答案：D典型方法掌握基因工程的各種工具酶的作用及其特點(diǎn)是解答此類題型的關(guān)鍵。①不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同;同一個(gè)DNA分子用不同限制酶切割,產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。另外，不同限制酶切割形成的黏性末端,如互補(bǔ)，則可以相互重新配對.②判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是,將黏性末端旋轉(zhuǎn)180°,應(yīng)該是完全相同的結(jié)構(gòu).③DNA連接酶的作用對象包括：a。兩個(gè)相同的黏性末端(同一種限制酶切割形成的DNA片段末端)；b.任意兩個(gè)平末端；c。雖不同但拼接在一起能夠堿基互補(bǔ)的兩個(gè)黏性末端。變式訓(xùn)練下列黏性末端屬于同一限制酶切割而成的是（）A．①② B．①③ C．①④ D．②③解析：將兩個(gè)黏性末端旋轉(zhuǎn)180°進(jìn)行比較,只有①③相同，因此①③屬于同一種限制酶切割形成的末端。答案：B探究點(diǎn)二基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體·問題導(dǎo)引·我國科學(xué)家已成功將與植物花青素代謝有關(guān)的基因?qū)牖ɑ苤参锇珷颗Ｖ?，轉(zhuǎn)基因矮牽牛呈現(xiàn)出自然界沒有的顏色變異，大大提高了花卉的觀賞價(jià)值.思考:科學(xué)家進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作時(shí)，可以將外源基因與質(zhì)粒拼接在一起構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)是什么？質(zhì)粒來源于何類生物？討論質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)對外源基因所起的作用.提示:質(zhì)粒是小型雙鏈環(huán)狀DNA分子,主要存在于原核細(xì)胞中.質(zhì)粒能攜帶外源基因在受體細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制；質(zhì)粒還能使外源基因順利表達(dá)等?！っ麕熅v·1．載體的基本作用（1）作為運(yùn)載工具，將目的基因運(yùn)送到受體細(xì)胞中去。（2）在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制和穩(wěn)定保存。2．需具備的條件（1）對受體細(xì)胞無害,不影響受體細(xì)胞正常的生命活動(dòng).(2)具有自我復(fù)制能力，或能整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制.（3)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體中.(4）帶有遺傳標(biāo)記基因,便于基因重組后對其進(jìn)行篩選.(5)載體DNA分子大小適合，便于提取和進(jìn)行體外操作。特別提醒①基因工程中的載體與細(xì)胞中物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體不同,基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。②一般來說，天然載體往往不能滿足上述要求,因此需要根據(jù)不同的目的和需要，對載體進(jìn)行人工改造。真正被用作載體的質(zhì)粒,都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造的。③載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理：載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞,原理如下圖所示：3．常用種類種類用途質(zhì)粒將外源基因載入大腸桿菌等宿主細(xì)胞λ噬菌體的衍生物植物病毒將外源基因載入植物細(xì)胞動(dòng)物病毒將外源基因載入動(dòng)物細(xì)胞特別提醒在選擇動(dòng)植物病毒作載體時(shí)，應(yīng)選擇DNA病毒，以便插入目的基因?！纠}2】質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，它的主要特點(diǎn)是（）①能自主復(fù)制②不能自主復(fù)制③結(jié)構(gòu)簡單④是蛋白質(zhì)⑤是環(huán)狀RNA⑥是環(huán)狀DNA⑦能“友好”地“借居