分子生物學第三章蛋白質大分子結構與功能

第三章蛋白質大分子1本章內容第一節(jié)蛋白質大分子構造與功能第二節(jié)蛋白質生物合成2第一節(jié)蛋白質大分子構造與功能3一、蛋白質的生物學意義〔功能〕蛋白質的生物學意義〔功能〕構造功能例如：膜蛋白、糖蛋白、核蛋白催化功能例如：酶運輸功能例如：載體，某些跨膜蛋白運動功能例如：肌球蛋白和肌動蛋白防御功能例如：抗體調控功能例如：阻遏蛋白,再激活因子恩格斯認為：蛋白質是生命的表現(xiàn)形式4膜蛋白5HA鏈球菌透明質酸的代謝網(wǎng)絡透明質酸生物合成過程6糖蛋白生物膜是磷脂雙分子層嵌有蛋白質的二維流體7

物質的跨膜運輸

轉運蛋白介導的主動運輸〔載體蛋白〕與被動運輸〔載體蛋白和通道蛋白〕8TheProtonPump9問題先有蛋白質，還是先有核酸？先有DNA,還是先有RNA?10二、蛋白質的元素組成四大生命元素：C、H、O、N有的蛋白質還有：磷、鐵、鋅、銅、鉬等氮在各種蛋白質中平均含量為16%。例題:通過凱氏定氮法測得某細菌培養(yǎng)物的N含量為1.25g,問該細菌中蛋白質含量為多少?

11三、蛋白質的氨基酸組成組成蛋白質的根本單位是氨基酸。如將天然蛋白質完全水解，最后都可得到約二十種不同的氨基酸。除脯氨酸外，其余均屬于α-氨基酸1213(一)氨基酸構造通式羧基寫在α-碳原子上端，氨基在左邊為L-型，氨基在右邊為D-型14(二)氨基酸的分類根據(jù)組成蛋白質的20種氨基酸的側鏈R基的化學構造，分為：脂肪族氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸芳香族氨基酸：苯丙氨酸雜環(huán)氨基酸：組氨酸、色氨酸雜環(huán)亞氨基酸：脯氨酸

15根據(jù)R側鏈基團解離性質的不同，可將氨基酸進展分類：

1.極性氨基酸：(1)酸性氨基酸——Glu，Asp；側鏈基團在中性溶液中解離后帶負電荷的氨基酸。

(2)堿性氨基酸——His，Arg，Lys；側鏈基團在中性溶液中解離后帶正電荷的氨基酸。

(3)中性氨基酸——側鏈基團在中性溶液中不發(fā)生解離，因而不帶電荷的氨基酸：Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys

2.非極性氨基酸：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe。16〔三〕氨基酸的理化性質1．兩性解離及等電點氨基酸分子是一種兩性電解質。通過改變溶液的pH可使氨基酸分子的解離狀態(tài)發(fā)生改變。

氨基酸分子帶有相等正、負電荷時，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點〔pI〕。

17182．紫外吸收性質組成天然蛋白質分子的20種氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有光吸收。其吸收峰280nm左右，以色氨酸吸收最強?？衫么诵再|采用紫外分分光度法測定蛋白質的含量。193.氨基酸的化學性質與茚三酮反響生成蘭紫色物質，但脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮生成黃色物質。與DNFB反響生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯氨酸〔DNP-氨基酸〕。DNP-氨基酸在有機溶劑中與其它氨基酸溶解度不同，用乙醚抽提，根據(jù)紙層析上的黃色斑點可鑒定N-端氨基酸的種類和數(shù)目〔Sanger等用此法測定了胰島素的一級構造〕20氨基酸與異硫氰酸苯酯的反響AA的氨基可與異硫氰酸苯酯(PITC)反響,生成苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)。所得PTC-AA經乙酸乙酯抽提→層析鑒定→確定N端氨基酸的種類?！岸嚯捻樞蜃詣臃治鰞x〞據(jù)此原理。生物公司已經進展蛋白質測序21英國生化學家弗雷德·桑格爾〔FrederickSanger，1918年8月13日—〕,分別獲得1958年和1980年諾貝爾化學獎。他是同一領域內兩次獲獎，兩次獲獎理由都可歸結為：測序。1958：弗雷德·桑格爾創(chuàng)造酶法測定人胰島素序列，從而確定胰島素的分子構造，開創(chuàng)了蛋白質測序領域。1980：弗雷德·桑格爾、沃爾特·吉爾伯特共同榮獲諾貝爾化學獎。他們奉獻在于：分別使用不同的方法測定DNA序列。Sanger法后來成為主流，并用于人類基因組方案〔HGP〕的測序。22蛋白質構造23四、肽肽：一個AA的α-羧基和另一個AA的α-氨基脫水縮合而成的化合物。肽建：氨基酸之間脫水后形成的鍵，又稱酰胺鍵24肽鏈中的氨基酸因脫水形成肽鍵而稱為氨基酸殘基肽的命名：例如谷胱甘肽肽與蛋白質的界定信號肽2526肽平面27肽的實例谷胱甘肽作為輔酶，在體內氧化復原過程中起作用催產素和加壓素促腎上腺皮質激素腦肽2829四、蛋白質的構造蛋白質構造分為：一級構造、二級構造、超二級構造、構造域、三級構造、四級構造〔一〕蛋白質的一級構造：蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序。一級構造在很大程度上決定其高級構造。30二硫鍵31一級構造確定的原那么測定蛋白質中氨基酸組成蛋白質N端和C端的測定2種以上方法水解蛋白質，得到一系列肽段別離提純所得肽，測其序列從有重疊構造的肽序列中推斷蛋白質的全部氨基酸的排列順序32〔二〕蛋白質的空間構造肽平面：肽腱中的4個原子以及相鄰的2個α-碳原子處在同一平面，使肽鏈具有一定的穩(wěn)定性331.蛋白質二級構造：α-螺旋、β-折疊、β-轉角、自由回轉等α-螺旋構造特點:每隔3.6個氨基酸殘基上升1圈。向上平移0.54nm,即每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm。α-螺旋體中氨基酸殘基側鏈伸向外側，相鄰螺旋之間形成氫鍵，氫鍵方向與中心軸平行。分左手螺旋和右手螺旋。343536α-螺旋β-折疊

肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈＞C＝O和＞N－H形成的氫鍵維持構造穩(wěn)定。平行排列：所有肽鏈的N端處于同一側，是同方向的。反向平行：肽鏈的N端一順一倒排列。反向平行構造更穩(wěn)定。37紅球代表O原子;白球代表N原子紫色球代表R側鏈；38紅球代表O原子;白球代表N原子；紫色球代表R側鏈3940β-轉角多肽鏈中180度回折，第一個AA殘基的＞C＝O和第四個AA殘基的＞N－H形成的氫鍵41自由回轉無規(guī)那么卷曲,沒有一定規(guī)律的松散構造,酶的功能部位常常處于這種構象區(qū)域里。422.超二級構造和構造域超二級構造：假設干相鄰的二級構造中的構象單元,形成二級構造組合體。例如，βαβ，βββ，αα，ββ等。43444546構造域多肽鏈在超二級構造根底上進一步卷曲折疊成嚴密的近似球狀的構造。對較小蛋白質分子，構造域往往就是三級構造，即這些蛋白質是單構造域。許多蛋白質是多構造域。47構造域483.蛋白質三級構造多肽鏈的某些區(qū)域氨基酸形成二級構造:α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)那么卷曲等構象單元,然后相鄰二級構造集裝成超二級構造,進而折疊繞曲成構造域,由2個或2個以上的構造域組裝成三級構造。如肌紅蛋白。494.蛋白質四級構造一個蛋白質由幾條多肽鏈組成1個活性單位。亞基的相互關系，空間排布，亞基間通過非共價鍵聚合成的特定構象。單一亞基無活性，只有聚合后才有生物活性。如血紅蛋白。5051蛋白質預測網(wǎng)站

ComputepI/WM://expasy.hcuge.chPredictprotein://embl-heidelberg.de/predictprotein/SOPMA://ibcp.fr/predict.htmlUnpredict://www/52蛋白質信息資源〔PIR):///Dan/proteins/pir.html蛋白質構造數(shù)據(jù)庫〔PDB):///北大生物信息學中心://53MKRSKRFAVLAQRPVNQDGLIGEWPEEGLIAMDSPFDPVSSVKVDNGLIVELDGKRRDQF

DMIDRFIADYAINVERTEQAMRLEAVEIARMLVDIHVSREEIIAITTAITPAKAVEVMAQ

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IAIPDERILAIYNALRPFRSSQAELLAIADELEHTWHATVNAAFVRESAEVYQQRHKLRK

GS

等電點/分子量理論值:5.26/92840.80

舉例--甘油脫水酶的3個亞基序列54DeducedsecondarystructureoffusionproteindhaB123Alphahelix(Hh):399is47.39%310helix(Gg):0is0.00%Pihelix(Ii):0is0.00%Betabridge(Bb):0is0.00%Extendedstrand(Ee):125is14.85%Betaturn(Tt):76is9.03%Bendregion(Ss):0is0.00%Randomcoil(Cc):242is28.74%Ambigousstates(?):0is0.00%Otherstates:0is0.00

55Green:αsubunitYellow:theactivesiteCyan:βsubunitGray:γsubunitMagenta:B12molecule

甘油脫水酶空間構造56〔三〕蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵共價鍵：肽鍵、二硫鍵次級鍵：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力。57五、蛋白質分子構造與功能的關系〔一〕蛋白質一級構造與功能的關系種屬差異分子病〔二〕蛋白質構象與功能的關系別構現(xiàn)象〔變構效應〕：蛋白質表現(xiàn)其功能時構象發(fā)生變化。5859六、蛋白質的性質〔一〕蛋白質的相對分子量〔二〕蛋白質的兩性解離及等電點蛋白質等電點：溶液在某一pH值時，蛋白質所帶正電荷與負電荷相等，在電場中，蛋白質分子既不向正極也不向負極移動。此時溶液的pH值稱為蛋白質等電點。60蛋白質電泳蛋白質電泳的方向取決于所帶電荷的正負性、所帶電荷的多少、及分子顆粒大小。聚丙烯酰胺凝膠電泳61掩蓋了其他因素，電泳時只與分子量有關6263SDSSDS642DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀〔第二向〕電源等電聚焦儀〔第一向〕65Comparisonoffluorescentlabelled2-DgelwithsilverstainingCyTM5labelledgelSilverstainedgelE.colilysate,50

gloading,pH4-766〔三〕蛋白質的膠體性質透析法：小分子可以通過半透膜，而蛋白質不能，從而到達別離純化的目的。蛋白質分子外表分布著許多極性和非極性基團，非極性基團與脂溶性物質結合。而極性基團與水溶性物質結合形成水化層，水化層使蛋白質顆粒相互排斥，不會凝結沉淀。67〔四〕蛋白質的沉淀反響加高濃度鹽類：破壞水膜加有機溶劑：破壞水膜加重金屬鹽：蛋白質與重金屬離子生成不易溶解的鹽而沉淀。68〔五〕蛋白質的變性因受物理或化學因素的影響，蛋白質的分子構造發(fā)生變化，致使蛋白質的理化性質和生物學性質都有所改變，但一級構造不變。69〔六〕蛋白質的顏色反響雙縮脲反響：米倫氏反響：乙醛酸反響：坂口反響：酚試劑反響：70七、蛋白質的分類簡單蛋白質：只由α-氨基酸組成結合蛋白質：簡單蛋白質+非蛋白質局部〔輔基〕核蛋白：核酸+蛋白質糖蛋白與蛋白聚糖脂蛋白：脂類+蛋白質色蛋白：色素+蛋白質磷蛋白：磷酸+蛋白質71名人傳記王應睞72王應睞研究員,曾任中國科學院上海

分院院長，中科院上海生化所所長，比利時、匈牙利、捷克等國科學院名譽院士，1955年被選為中國科學院學部委員(院士)。王應睞院士是我國著名的生物化學家、近代生物化學科研事業(yè)的主要奠基人。首次證明豆科植物中含血紅蛋白。成功地組織了人工合成結晶牛胰島素與酵母丙氨酸轉移核糖核酸兩項重大根底性研究工作。1996年獲香港何梁何利基金科學技術成就獎。73名人傳記鄒承魯鄒承魯,1923年生,江蘇無錫人。1951年獲劍橋大學博士。中國科學院院士，第三世界科學院院士,生物物理所研究員。曾任中科院生物學部主任,全國政協(xié)委員、常委,中國生物化學與分子生物學會理事長。在國內外發(fā)表科學論文二百余篇。由于在胰島素人工合成，蛋白質和酶學方面的奉獻，曾獲第三世界科學院獎、陳嘉庚生命科學獎、國家自然科學及中科院自然科學獎屢次。自傳在國外出版的綜合生物化學叢書·生物化學史卷發(fā)表,對當代生物化學開展的奉獻已載入史冊。74鄒承魯照片75鄒承魯簡歷：由王應睞教授介紹去劍橋大學師從Keilin教授第一篇論文1949年在英國Nature雜志上發(fā)表，導師Keilin教授不署名1951年回國，在中國科學院上海生物化學研究所建立了研究組參與結晶牛胰島素的人工全合成1970年由上海調到北京生物物理所工作76科學家的境界追求

心無旁騖，割席斷交

管寧、華歆共園中鋤菜，見地有片金，管揮鋤與瓦石不異，華捉而擲之去。

又嘗同席讀書，有乘軒冕過門者，寧讀如故，歆廢書出看。寧割席分坐曰：子非吾友也。

77小結重要概念：等電點肽健肽平面α-螺旋β-折疊β-轉角超二級構造構造域別構現(xiàn)象結合蛋白鹽析蛋白質的構造：一級構造→二級構造→超二級構造→構造域→三級構造→四級構造有關蛋白質的化學反響蛋白質的別離提純78第二節(jié)蛋白質生物合成79遺傳密碼80蛋白質合成概述DNA:ATGCATGCATGCRNA:AUGCAUGCAUGCProtein:aa1aa2aa3aa4堿基序列決定氨基酸序列如何實現(xiàn)堿基序列到氨基酸序列的轉變？81TACTTTAAAGTATranscription-TheProductionofmRNARNAPolymerasebeginstowork!!StartHere!!AUUGGAAAAAAAStopHere!!82TACTTTAAAGTA83mRNAmovesoutofthenucleustoRoughEndoplasmicReticulumRoughERNuclearMembraneRibosomesmRNA84AAAGUATranslation-ProteinSynthesisCodonCodonUUUtRNAAntiCodonUACtRNAMethionineUUUtRNAPhenylalanine85Polypeptideformationviapeptidebonds.Translation-ProteinSynthesisRibosome(s)movealongmRNA.tRNAcarriersaminoacidsforbuildingpolypeptide.tRNAdropsawayfromribosome/mRNAonceamino-aciditcarriesisjoinedontothegrowingpolypeptideviapeptidebonds.86Primary,Secondary,TertiaryandQuaternaryStructure-ProteinSynthesisPrimarySecondaryTertiaryUnfoldedsinglepolypeptidestrandFoldedsinglepolypeptidestrand-Secondary&TertiarySeveralpolypeptidestrandsQuaternary87Translation-bigpictureInitiation:RecruitfMet-tRNAMet,mRNA,largeparticleElongation:SynthesizeproteinTermination:Stopsynthesis,releaseprotein88一、mRNAmRNA概念最初由F.Jacob和J.Monod1965年提出．當時推測，有一種信使在細胞核中合成后攜帶上遺傳信息進入細胞質，指導蛋白質合成，后來發(fā)現(xiàn)，除rRNA和tRNA之外的第三種RNA，稱為信使RNA(mRNA)。mRNA半衰期很短,一旦完成使命就被水解。原核生物和真核生物mRNA的構造差異較大，尤其是在5’端。89〔一〕原核生物mRNA的構造

1、

5’端SD序列在起始密碼子AUG上游9-13個核苷酸處，有一段可與核糖體16SrRNA配對結合的、富含嘌呤的3-9個核苷酸序列，一般為AGGA，此序列稱SD序列。它與核糖體小亞基內16SrRNA的3’端一段富含嘧啶的序列GAUCACCUCCUUA-OH〔暫稱反SD序列〕互補，形成氫鍵。使得結合于30S亞基上的起始tRNA能正確地定位于mRNA的起始密碼子AUG。90Ribosomebindingsite(RBS)orSD-sequenceinprokaryoticmRNA,complementarywiththesequenceatthe3’endof16SrRNA.structureofmRNA912、原核mRNA轉譯時，各個基因都有自己的SD序列、起始密碼子、終止密碼子，分別控制其合成的起始與終止，換言之，每個基因的翻譯都是相對獨立的。如E.coli，一個7000b的mRNA編碼5種與Trp合成有關的酶

多基因共表達載體構建時，可利用SD序列，將幾個基因串聯(lián)92〔二〕

真核生物mRNA的構造1、真核生物mRNA5’端均具有m7GpppN帽子構造，無SD序列。帽子構造具有增強翻譯的作用。假設起始AUG與帽子構造間的距離太近〔小于12個核苷酸〕，就不能有效利用這個AUG，會從下游適當?shù)腁UG起始翻譯。當距離在17-80個核苷酸之間時，離體翻譯效率與距離成正比。932、真核生物mRNA通常是單順反子。真核mRNA具有“第一AUG規(guī)律〞，即當5’端具有數(shù)個AUG時，只有1個AUG為主要開放閱讀框架的翻譯起點。起始AUG具有2個特點：〔i〕AUG上游的-3經常是嘌呤，尤其是A?！瞚i〕緊跟AUG的+4常常是G。起始AUG鄰近序列中，以ANNAUGGN的頻率最高。假設-3不是A，那么+4必須是G。無此規(guī)律的AUG，那么無起始功能。94OnceKozaksequenceEukaryoticmRNAusesamethylatedcaptorecruittheribosome.Oncebound,theribosomescansthemRNAina5’-3’directiontofindtheAUGstartcodon.Kozaksequenceincreasesthetranslationefficiency.Poly-Ainthe3’endpromotestheefficientrecyclingofribosomes9595KOZAK是一個女科學家

她研究過起始密碼子ATG周邊堿基定點突變后對轉錄和翻譯所造成的影響，并總結出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG時，轉錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。關于kozak序列的這篇文章發(fā)表在NucleicAcidsRes.1984上，該序列被后人稱為Kozak序列，并被應用于表達載體構建

96二、遺傳密碼氨基酸排列順序由mRNA的核苷酸順序決定。如果每2個核苷酸編碼1個氨基酸,那么4種核苷酸只有16種編碼方式。如果每3個核苷酸編碼1個氨基酸,那么有64種編碼方式,。如果4對1那么有256種,顯然沒必要?？茖W家們已用生物化學實驗證實3個堿基編碼1個氨基酸,稱為三聯(lián)體密碼或密碼子。97〔一〕遺傳密碼的破譯美國科學家M.W.Nirenberg等人破譯了遺傳密碼,于1968年獲得諾貝爾生理醫(yī)學獎.早在1961年，M.W.Nirenberg等人在大腸桿菌的無細胞體系中外加poly(U)模板、20種標記的氨基酸，經保溫后得到了多聚phe-phe-phe，于是推測UUU編碼phe。利用同樣的方法得到CCC編碼pro，GGG編碼gly，AAA編碼lys。如果利用poly〔UC〕，那么得到多聚Ser-Leu-Ser-Leu，推測UCU編碼Ser，CUC編碼Leu，因為poly〔UC〕有兩種讀碼方式：UCU——CUC和CUC——UCU采用該方式，到1965年就全部破譯了64組密碼子。98〔二〕遺傳密碼的特點在64個密碼子中有61個編碼氨基酸，3個不編碼任何氨基酸而起肽鏈合成的終止作用，稱為終止密碼子，它們是UAG、UAA、UGA，密碼子AUG〔編碼Met〕又稱起始密碼子?！簿幋a鏈上那么為TAG、TAA、TGA、ATG〕密碼子：mRNA上由三個相鄰的核苷酸組成一個密碼子，代表肽鏈合成中的某種氨基酸或合成的起始與終止信號?！?〕方向性：從mRNA的5’到3’99〔2〕連讀性從起始密碼子到終止密碼子構成一個連續(xù)的閱讀框架〔ORF〕〔不包括終止密碼子〕。如果在閱讀框中插入或刪除一個堿基就會使其后的讀碼發(fā)生移碼。兩個基因之間或兩個ORF之間可能會互相局部重疊〔共用局部序列〕。〔3〕簡并性幾種密碼子編碼同一種氨基酸稱為密碼子簡并性。如GGN〔GGA、GGU、GGG、GGC〕都編碼Gly，這4種密碼子稱為Gly的簡并密碼。只有Met和Trp沒有簡并密碼。一般情況下密碼子簡并性只涉及第三位堿基。100問題：簡并性的生物學意義？可以降低由于遺傳密碼突變造成的物種災難試想，如果每種氨基酸只有1個密碼子，如果一旦哪個氨基酸的密碼子發(fā)生了單堿基的點突變，那么極有可能造成肽鏈合成的過早終止。例如，由于簡并性的存在，不管第三位的U變成什么，都仍然編碼Ala101〔4〕搖擺性密碼子中第3位堿基與反密碼子第1位堿基配對不一定完全遵循A-U、G-C的原那么，即密碼子的第1、2位是嚴謹配對的，第3位嚴謹度低。密碼子第3位和反密碼子的第1位是搖擺位點，Crick稱之為搖擺性。反密碼子第1位的G可以與密碼子第3位的C、U配對，U可以與A、G配對，另外反密碼子中還經常出現(xiàn)罕見的I，可以和密碼子的U、C、A配對，這使得該類反密碼子的閱讀能力更強。102103問題：細胞內有幾種tRNA？遺傳密碼破譯后，由于有61個密碼子編碼氨基酸，于是預測細胞內有61種tRNA，但事實上絕大多數(shù)細胞內只有50種左右，Crick提出的搖擺假說合理解釋了這種情況。根據(jù)搖擺性和61個密碼子，經過仔細計算，要翻譯61個密碼子至少需要31種tRNA，外加1個起始tRNA，共需32種。但在葉綠體和線粒體內，由于基因組很小，密碼子少，葉綠體內就有30種左右tRNAs，線粒體只有24種?！?〕通用性：密碼子在不同物種間幾乎是完全通用的。目前只發(fā)現(xiàn)線粒體和葉綠體內有例外情況。但是不同生物往往偏愛某一種密碼子。104三、

核糖體核糖體又稱核蛋白體，是蛋白質合成場所.標記各種氨基酸，注入大鼠體內，在不同時間取出肝臟，勻漿，離心別離各種亞細胞器，分析放射性蛋白的分布，證實蛋白質合成在核糖體上進展。就真核細胞而言，核糖體按其在細胞質中的位置分為游離核糖體〔合成細胞質蛋白〕和內質網(wǎng)核糖體〔合成分泌蛋白和細胞器蛋白〕。105106不管原核細胞還是真核細胞，一條mRNA可以同時被幾個核糖體閱讀，把同時結合并翻譯同一條mRNA的多個核糖體稱為多核糖體。107108〔一〕核糖體的構造與組成〔2021年諾貝爾化學獎〕核糖體是由核糖核酸〔rRNA〕和幾十種蛋白質〔核糖體蛋白〕組成的巨大復合體。不同生物中核糖體的構造高度保守，盡管其rRNA和核糖體蛋白的一級構造有所不同，但其三級構造卻驚人相似。核糖體是核酸和蛋白密切合作的表達！109每個核糖體是由大小兩個亞基組成，每個亞基都有各自不同的rRNA和蛋白質分子核糖體的大亞基上有兩個重要的位點：P位點是結合肽酰tRNA的肽?；奈稽c，A位點是結合氨酰tRNA的氨?；奈稽c。110〔二〕rRNA與核糖體蛋白的構造與功能1、rRNA的構造與功能構造：有大量莖環(huán)〔發(fā)夾〕構造，可能是核糖體的鋼筋骨架。功能：〔1〕蛋白質合成的施工平臺〔2〕參與tRNA與mRNA的結合mRNA先識別rRNA的特定序列并結合固定,然后tRNA再識別并固定到rRNA特定部位，其反密碼子才與mRNA密碼子配對。16SrRNA上有一段序列與原核mRNA上的SD序列相結合。111〔3〕在大小亞基的聚合中起作用〔4〕在翻譯的校正和調控方面有重要功能〔如可結合調控因子〕總的來說，RNA分子似乎是整個核糖體的活性中心。1122、

核糖體蛋白的構造與功能構造：大多數(shù)核糖體蛋白呈纖維狀〔可能起骨架作用〕，少數(shù)呈球狀〔可能起生物功能〕。功能：(1)維持核糖體的構造(2)一些核糖體蛋白具有DNA構造〔Heilix—turn—Heilix模塊〕；還有些真核核糖體蛋白具有DNA修復功能113四、蛋白質合成的機理真核和原核生物在蛋白質合成方面有共同之處,以下為蛋白質合成的一般過程。游離氨基酸在摻入肽鏈前須先活化以獲得能量，每一種游離氨基酸須在專一的氨酰tRNA合成酶作用下與專一的tRNA相連〔稱為裝載〕，然后由tRNA將它帶至核糖體的特定位點〔A位點〕并添加到正在合成的肽鏈C端。這種從游離氨基酸到形成氨酰tRNA的過程是氨基酸活化過程。114〔一〕氨酰tRNA合成酶：氨基酸活化和氨酰tRNA合成是蛋白質合成的第一步，由氨酰tRNA合成酶催化，該酶既能識別氨基酸，又能識別tRNA。1、活化在Mg2+存在下，氨酰tRNA合成酶首先識別并結合專一的配體氨基酸，然后氨基酸的羧基與ATP發(fā)生反響形成一個酸酐型的高能復合物〔氨酰AMP中間復合物〕，該中間復合物暫時結合在酶上。

酶/Mg2+氨基酸+ATP→氨酰AMP-酶+PPi115AMP1162、連接氨酰tRNA合成酶有專一的tRNA識別位點，因此游離tRNA就會識別并結合到氨酰AMP-酶復合物的活性部位，氨基酸被轉移到tRNA的3端，其羧基與tRNA3端的自由-OH形成氨酰酯鍵，從而形成氨酰tRNA，此為高能化合物，其能量足以形成肽鍵。由于氨酰tRNA能量低于氨酰AMP，所以這一過程是自發(fā)的。

tRNA

+氨酰AMP-酶→氨酰tRNA+AMP+酶

117117aa-tRNAsynthase118ComplexofClassITyr-tRNAsynthetasewithtRNAtyr

Fig.Interactionsbetweentyrosyl-tRNAsynthetaseandtRNAtyr.(A)TheC-terminaldomain(orange)bindsintheelbowbetweenthelongvariablearmandtheanti-codonstemofthetRNA(redbackbone,greenbases).Theanti-codonstemloopinteractswithboththeC-terminaldomainandthe-helicaldomain(pink).ThetRNAmakesnocontactwiththecatalyticdomainofthesamesubunit(cyan).(B)Theunusualconformationoftheanti-codontripletinwhichAde-36isstackedonGua-34,whilePsu-35bulgesout.(C)Base-specificinteractionsofAsp-259fromthe-helicaldomainwithGua-34andAsp-423fromtheC-terminaldomainwithPsu-35.119mRNA120氨酰tRNA的去向由tRNA來決定，tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA上密碼子相識別。結論：〔1〕氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白質生物合成的第一步，活化和連接都發(fā)生在氨基酸的羧基上?！?〕載體tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA上的密碼子識別而把所攜帶的氨基酸送到肽鏈的一定位置上〔3〕遺傳信息是通過mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子間堿基配對作用而傳遞。121氨酰tRNA合成酶：氨酰tRNA合成酶既能識別氨基酸，又能識別tRNA，從而使氨基酸與tRNA相對應，故把氨酰tRNA合成酶的雙向識別功能稱為第二遺傳密碼。122不同氨酰tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亞基組成上差異較大。其識別氨基酸的機理尚不太清楚。一些氨基酸構造極其相似，盡管Ile與Val僅差一個甲基,但tRNAIle合成酶也能正確識別。偶爾也錯誤形成Val–tRNAIle，但是氨酰-tRNA合成酶都有一個校正位點，由于大小原因，只有Val–tRNAIle才能結合到校正位點，然后合成酶將Val又從tRNAIle上將其水解下來。123氨酰tRNA合成酶能正確識別和結合tRNA，一些氨酰tRNA合成酶識別tRNA上的反密碼子，以及tRNA上的受體莖環(huán)〔acceptorstem〕。tRNA分子的突變與校正基因tRNA是一個萬能接頭：〔1〕有氨酰-tRNA合成酶的識別位點〔接頭合成酶〕〔2〕3端-CCA上的氨基酸運載位點〔接頭氨基酸，裝載〕〔3〕有核糖體的識別位點〔將氨基酸運送到目的地〕〔4〕反密碼子位點〔接頭mRNA，驗貨并卸載〕124回復突變：突變型生物有時通過遺傳物質的變化重新獲得其原有表型，被回復的生物稱為回復子?；貜屯蛔兊脑蚝芏啵幸环N回復突變是其基因上發(fā)生一個突變而引起，稱為基因校正突變。大多數(shù)基因較正突變發(fā)生在tRNA基因上。125〔二〕蛋白質合成的一般過程可以分為三個階段：起始、延伸、終止，分別由不同的起始因子、延伸因子和終止因子〔釋放因子〕參與。126Fig14-14Overviewoftheeventsoftranslation/ribosomecycle127Polysome/polyribosome:anmRNAbearingmultipleribosomesEachmRNAcanbetranslatedsimultaneouslybymultipleribosomesFig14-15Apolyribosome1281、翻譯起始〔1〕小亞基與mRNA結合〔2〕起始氨酰tRNA進入P位點，其反密碼子與mRNA上的起始密碼子AUG堿基配對。〔3〕大亞基與小亞基結合形成起始復合物。1292、延伸方向：mRNA5/3/新生肽：N/C/〔1〕就位：第二個氨酰tRNA通過密碼子—反密碼子的配對作用進入核糖體的A位點〔氨基位點〕。〔2〕轉肽：在大亞基上肽酰轉移酶作用下，A位點氨基酸的α-氨基親核攻擊P位點上氨基酸的羧基并形成肽鍵，結果兩個氨基酸均連到A位點的tRNA上，該過程稱為轉肽作用，此時，P位點上卸載的tRNA從核糖體上離開。〔3〕移位〔translocation〕：核糖體沿著mRNA移動1個密碼子位置，tRNA移位到P位點，A位點空出以便接納下一個氨基酸。1303、

終止由于終止密碼子不能結合任何氨酰tRNA，于是終止因子〔又稱釋放因子〕識別并結合到終止密碼子上，接著肽轉移酶的酯化酶功能轉變成水解功能，將肽鏈從P位點tRNA上水解掉，核糖體釋放掉mRNA并解體成大小亞基，翻譯完畢。在翻譯過程中除了核糖體大小亞基、mRNA和氨酰tRNA外，還需要GTP和許多蛋白輔助因子。這些輔助因子有的起催化作用，有的起改變和穩(wěn)定構象作用。1314、翻譯后加工一些肽鏈翻譯完成后，能直接折疊成最終的活性形式，不需加工修飾。然而許多新生肽鏈需要翻譯后加工或修飾,包括：〔1〕切除局部肽段〔蛋白酶〕，例如，酶原激活〔2〕在特定氨基酸殘基側鏈上添加基團〔共價修飾〕，例如糖基化、羥基化〔3〕插入輔因子，還有些單肽要聚合折疊成多亞基蛋白。132分子伴侶〔MolecularChaperones〕

定義：與新生肽鏈形成復合物并協(xié)助它正確折疊成具有生物功能構象的蛋白質，協(xié)助多肽鏈跨膜轉運以及多亞基蛋白質的組裝和解體，但它不屬于新生肽鏈的組成局部。在原核表達時使用分子伴侶，減少包涵體的形成133包涵體-蛋白表達時的雙刃劍包涵體是指細菌表達的重組蛋白在細胞內凝集，形成無活性、不溶性的固體顆粒。包涵體的存在常使得細胞破碎后很渾濁。

包涵體中一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等.

134包涵體的形成原因主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。

1、表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進展折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法到達足夠的溶解度等。

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。

3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。

4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

135包涵體表達的有利因素1、可溶性蛋白在細胞內容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達可以防止蛋白酶對外源蛋白的降解。

2、降低了胞內外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高。

3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白別離，有利于別離純化。

4、對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細胞膜碎片別離。

136提高目的蛋白的可溶性的策略〔1〕在細胞中表達分子伴侶〔天然或異源〕，輔助新生肽鏈折疊，防止

肽鏈相互聚合；

〔2〕共表達折疊酶，催化共價鍵形成；

〔3〕通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚

合傾向的中間體的濃度；

〔4〕選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合

成速度；

〔5〕選擇適合的宿主菌株；

〔6〕表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；

〔7〕蛋白質的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關，因此可利用誘突

技術改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；

〔8〕誘導過程中參加化學物質，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。

137★在蛋白質折疊中有兩類分子伴侶：〔1〕Hsp70s。Hsp70s是在折疊早期階段起作用的分子伴侶家族。大量的Hsp70s。大量的Hsp70s單體結合在未折疊的疏水的正延伸肽段上。每一個Hsp70s有兩個結合位點：未折疊多肽結合位點和ATP結合位點。多肽從Hsp70s上釋放需要能量。內質網(wǎng)的Hsp70s還是多肽跨膜轉運所必須的?！?〕Hsp60s。一旦未折疊的多肽從Hsp70s上被釋放，它就結合到一些Hsp60s上〔也稱chaparonins,cpn60s〕。Hsp60s形成一個巨大的桶狀構造，它有兩個蓋，未折疊蛋白進入桶中，Hsp60s幫助它形成正確的構造。分子伴侶還能幫助因各種脅迫而局部去折疊蛋白的重新折疊，如果不能重新折疊的話，分子伴侶就促進它的降解。138139伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進蛋白質折疊過程

伴侶素的主要作用——為非自發(fā)性折疊蛋白質提供能折疊形成天然空間構象的微環(huán)境。140分子伴侶的應用及根底研究文獻作用：促進原核表達蛋白的可溶性LuciaBanci,etal.MolecularchaperonefunctionofMia40triggersconsecutiveinducedfoldingstepsofthesubstrateinmitochondrialproteinimport.PNAS,2021,107:20210-20215StephanieMateriaetal.Clusterin(ApolipoproteinJ),aMolecularChaperoneThatFacilitatesDegradationoftheCopper-ATPasesATP7AandATP7B.J.Biol.Chem.,2021,286:10073-10083141翻譯后加工的目的：〔1〕功能需要〔2〕定向轉運的需要〔真核生物中尤為復雜，合成的蛋白要定向運輸?shù)郊毎|、質膜、各種細胞器如葉綠體、線粒體、溶酶體、過氧化物酶體等〕。盡管原核生物與真核生物在蛋白質合成方面有許多相似之處，但也存在差異，這些差異正是一些抗生素治療和研究應用的根底。

142非核糖體合成肽(NRP)MorganA.Wyatt,etal.StaphylococcusaureusNonribosomalPeptideSecondaryMetabolitesRegulateVirulence.Science,2021,329:294-296HervéRoyandMichaelIbba.Bridgingthegapbetweenribosomalandnonribosomalproteinsynthesis.PNAS,2021,107:14517-14518143Aminoacyl-tRNAsynthetases(aaRSs)aretheenzymesnormallyrespons