生物學(xué)基本技能 教案 Ⅶ 顯微操作

基本技能Ⅶ顯微操作一、目標(biāo)與任務(wù)本次教學(xué)主題基本技能Ⅶ顯微操作學(xué)時(shí)授課班級(jí)授課日期授課地點(diǎn)主講教師實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解各種顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)。2.掌握一般顯微鏡的使用方法技能分解顯微鏡的分類顯微鏡介紹及其使用方法實(shí)驗(yàn)操作實(shí)訓(xùn)思政元素培養(yǎng)細(xì)微的觀察力；提高動(dòng)手操作能力教學(xué)方法講授法、演示法、討論法、案例分析法、課堂觀摩法、實(shí)訓(xùn)法教學(xué)媒體教材、課件、教案、多媒體、投影儀二、教學(xué)進(jìn)度教學(xué)過程教學(xué)內(nèi)容教學(xué)活動(dòng)教學(xué)時(shí)間（分鐘）教師活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)理論知識(shí)講授一、顯微鏡的分類顯微鏡是由一個(gè)透鏡或幾個(gè)透鏡組合構(gòu)成的一種光學(xué)儀器，主要用于將微小物體放大至人的肉眼能看到。（一）顯微鏡的具體分類通常情況下，顯微鏡分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。常見的光學(xué)顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、解剖顯微鏡、倒置顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、偏光顯微鏡、視頻顯微鏡、超聲波掃描顯微鏡等。常見的電子顯微鏡有掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡等。按使用目鏡的數(shù)目可分為單目顯微鏡、雙目顯微鏡和三目顯微鏡三大類。按其用途以及應(yīng)用范圍可分為生物顯微鏡、解剖顯微鏡、金相顯微鏡等。按光學(xué)原理可分為偏光顯微鏡和相差顯微鏡等。按光源類型可分為普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等。按顯微鏡物鏡的位置又可分為正置顯微鏡和倒置顯微鏡等。（二）顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域（三）性能指標(biāo)在顯微鏡的性能指標(biāo)中最重要的是分辨率，其他如鏡口率、放大率、焦點(diǎn)深度、鏡像亮度和視野亮度也各有其重要意義。二、顯微鏡介紹及其使用方法（一）普通光學(xué)顯微鏡1.成像原理又稱明視野顯微鏡，物鏡和目鏡的作用都相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡。首先光射到物體上，再?gòu)奈矬w射入物鏡和目鏡，最后射入觀察者的眼睛，在此過程中成像并放大。成像過程為被檢標(biāo)本是放在物鏡下方1～2倍焦距處，所以物鏡可使標(biāo)本在物鏡上方形成倒立放大的實(shí)像。該實(shí)像正好在目鏡下焦點(diǎn)以內(nèi)，通過目鏡又形成倒立放大的虛像；經(jīng)過調(diào)焦可使該像在眼睛的明視距離內(nèi)，最后通過眼球晶狀體在視網(wǎng)膜上成為正立的像。2.結(jié)構(gòu)特征在結(jié)構(gòu)上分為光學(xué)、照明和機(jī)械三部分。光學(xué)部分是主要部件，決定光學(xué)性能，但仍需后兩者的精密配合，才能有效地發(fā)揮作用。3.操作方法低倍鏡、高倍鏡、油鏡4.注意事項(xiàng)（二）解剖顯微鏡1.成像原理解剖顯微鏡成像采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角（一般為12°～15°），因而能形成三維空間的立體圖像，并具有立體感強(qiáng)、成像清晰寬闊、長(zhǎng)工作距離（通常為110mm）以及連續(xù)放大觀看等特點(diǎn)。2.結(jié)構(gòu)特征光學(xué)系統(tǒng)、機(jī)械系統(tǒng)3.操作方法4.注意事項(xiàng)（三）倒置顯微鏡1.成像原理倒置顯微鏡的組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡的焦距。目鏡的作用與放大鏡一樣。不同的是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體在物鏡已放大一次的像。2.結(jié)構(gòu)特征主要分為三部分：光學(xué)系統(tǒng)、照明系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)：物鏡裝在鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)器上，一般有3～4個(gè)物鏡；目鏡裝在鏡筒的上端，通常備有2～3個(gè)。照明系統(tǒng)：反光鏡、集光器、聚光鏡、光圈。機(jī)械系統(tǒng)：鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺(tái)、調(diào)節(jié)器。3.操作方法4.注意事項(xiàng)（四）暗視野顯微鏡1.成像原理也叫超顯微鏡，是利用丁達(dá)爾效應(yīng)的原理（當(dāng)一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”,這種現(xiàn)象即丁達(dá)爾效應(yīng)），在普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上換裝暗視野聚光器后改造而成的。暗視野聚光器，內(nèi)部有一拋物面結(jié)構(gòu)的遮擋,使照射在待檢物體表面的光線不能直接進(jìn)入物鏡和目鏡，僅散射光能通過，因而視野是黑暗的。由于暗視野顯微鏡不將透明光射入直接觀察系統(tǒng)，無物體時(shí)，視野暗黑，不可觀察到任何物體；當(dāng)有物體時(shí)，以物體衍射回的光與散射光進(jìn)入物鏡，在暗的背景中形成物體的明亮像。在暗視野顯微鏡下觀察物體，照明光大部分被折回，由于物體(標(biāo)本)所在的位置結(jié)構(gòu)、厚度不同，光的散射性和折光有很大變化。2.結(jié)構(gòu)特征反光鏡、物鏡、方位光闌、光源、暗視野的維持。3.操作方法4.注意事項(xiàng)（五）相差顯微鏡1.成像原理利用光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對(duì)比，可使人眼觀察到無色透明物體中的細(xì)節(jié)。鏡檢時(shí)光源只能通過環(huán)狀光闌的透明圓環(huán)，經(jīng)聚光器后聚成光束，這束光線通過被檢物體時(shí)，因各部分的光程不同，光線發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點(diǎn)平面和相板上的共軛面重合。因此，未發(fā)生偏斜的直射光便通過共軛面，而發(fā)生偏斜的衍射光由補(bǔ)償面通過。由于相板上的共軛面和補(bǔ)償面的性質(zhì)不同，它們分別使通過這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱，兩組光線再經(jīng)后透鏡的會(huì)聚，又復(fù)在同一光路上行進(jìn)，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。2.結(jié)構(gòu)特征環(huán)狀光闌、相位板、中心望遠(yuǎn)鏡、光源和濾光片3.操作方法4.注意事項(xiàng)（六）熒光顯微鏡1.成像原理它是一種較為常用的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，用于對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。2.結(jié)構(gòu)特征熒光顯微鏡觀察由短波光（紫外、紫、藍(lán)等）激發(fā)的生物物質(zhì)或經(jīng)熒光劑（熒光染料）標(biāo)記（或染色）的物質(zhì)所發(fā)生的熒光，它具備以下結(jié)構(gòu)：能產(chǎn)生短波光的光源、激發(fā)濾光片、吸收（護(hù)目）濾光片等。3.操作方法（以XST-2型實(shí)驗(yàn)用熒光顯微鏡為例）4.注意事項(xiàng)（七）激光掃描共聚焦顯微鏡1.成像原理采用激光束作光源，激光束通過照明針孔，由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中如有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測(cè)針孔時(shí)先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測(cè)收集，并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)，處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。在這個(gè)光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測(cè)針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測(cè)小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點(diǎn)的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。2.結(jié)構(gòu)特征在結(jié)構(gòu)配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等。3.操作方法（以瑞士徠卡公司的TCSSP5型激光共聚焦顯微鏡為例）4.注意事項(xiàng)（八）偏光顯微鏡1.成像原理（1）雙折射性：當(dāng)光線通過各向異性物質(zhì)時(shí)，因照射光的方向不同，使光速、折射率、吸收光振動(dòng)面和振幅均產(chǎn)生差別，具有這種性質(zhì)的物質(zhì)在光學(xué)上稱為各向異性物質(zhì)。這種物質(zhì)又都具有雙折射性，故也稱雙折射體。（2）光的偏振：自然光通過雙折射體后變成只在一個(gè)方向上振動(dòng)的光稱為偏振光。（3）尼科爾棱鏡：尼科爾棱鏡是將具有一定方向性的兩塊方解石用樹膠黏合而成的。（4）正交尼科爾棱鏡下置放雙折射體的明暗變化。（5）正交尼科爾棱鏡下置放單折射體的明暗變化。根據(jù)上述原理，在偏光顯微鏡下可確定樣品是雙折射體還是單折射體。2.結(jié)構(gòu)特征光源、特殊的載物臺(tái)、干燥系物鏡、目鏡3.操作方法4.注意事項(xiàng)（九）視頻顯微鏡1.成像原理當(dāng)使用視頻顯微鏡拍攝景物時(shí)，物體反射的光線通過視頻顯微鏡的內(nèi)置鏡頭透射到電荷耦合元件（CCD）上。當(dāng)CCD曝光后，光電二極管受到光線激發(fā)而釋放出電荷，生成感光元件的電信號(hào)。CCD控制芯片利用感光元件中的控制信號(hào)線路對(duì)發(fā)光二極管產(chǎn)生的電流進(jìn)行控制，由電流傳輸電路輸出，CCD會(huì)將一次成像產(chǎn)生的電信號(hào)收集起來，統(tǒng)一輸出到放大器。經(jīng)過放大和濾波后的電信號(hào)被傳送到模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC），由ADC將電信號(hào)(模擬信號(hào))轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。數(shù)值的大小和電信號(hào)的強(qiáng)度與電壓的高低成正比，這些數(shù)值其實(shí)也就是圖像的數(shù)據(jù)。此時(shí)這些圖像數(shù)據(jù)不能直接生成圖像，還要輸出到數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)中。在DSP中，將會(huì)對(duì)這些圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行色彩校正、白平衡處理，并編碼為視頻顯微鏡所支持的圖像格式、分辨率，然后才會(huì)被存儲(chǔ)為圖像文件。2.結(jié)構(gòu)特征主機(jī)架上有多處照明光源燈殼、照像裝置、記錄裝置、電視發(fā)生器和光電元件的連接口，這些連接口與成像光路系統(tǒng)之間不可能同時(shí)接通光路。3.操作方法4.注意事項(xiàng)（十）超聲波掃描顯微鏡1.成像原理利用超聲波脈沖回波的性質(zhì)，激勵(lì)壓電換能器發(fā)射出多束超聲波通過耦合液介質(zhì)傳遞到被測(cè)樣品，聲波的這種機(jī)械波傳遞過程類似電磁波，在經(jīng)過不同介質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射、反射等，通過聲阻抗不同的材料時(shí)會(huì)發(fā)生波形相位、能量變化等，經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)采集計(jì)算形成灰度值圖像，可用來分析樣品的內(nèi)部狀況。2.結(jié)構(gòu)特征3.操作方法（以德國(guó)PVA超聲波掃描顯微鏡為例）4.注意事項(xiàng)（十一）掃描電子顯微鏡1.成像原理2.結(jié)構(gòu)特征由三大部分組成：真空系統(tǒng)、電子束系統(tǒng)和成像系統(tǒng)。3.操作方法4.注意事項(xiàng)（十二）透射電子顯微鏡1.成像原理2.結(jié)構(gòu)特征包括電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、電氣系統(tǒng)、水冷卻循環(huán)系統(tǒng)和壓縮空氣系統(tǒng)等。主體是電子光學(xué)系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱鏡筒。3.操作方法4.注意事項(xiàng)板書；講解；分析；提問；操作師范領(lǐng)會(huì)；選擇性做筆記；思考、回答；練習(xí)實(shí)驗(yàn)操作實(shí)訓(xùn)（1）打印幾種顯微鏡圖片，要求學(xué)生識(shí)別出不同種類的顯微鏡，重點(diǎn)考察不同種類顯微鏡的結(jié)構(gòu)區(qū)別。（2）讓學(xué)生用普通光學(xué)顯微鏡觀察常規(guī)切片標(biāo)本