T-ZNZ 251-2024 淡水魚及其養(yǎng)殖水體中嗜水氣單胞菌的分離和藥敏試驗(yàn)方法

ICS07.100.99CCSB41T/ZNZAntimicrobialsusceptibilitytestingforAeromonashydrophila浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會(huì)發(fā)布IT/ZNZ251—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所、浙江省淡水水產(chǎn)研究所、湘湖實(shí)驗(yàn)室（農(nóng)業(yè)浙江省實(shí)驗(yàn)室）、溫州科技職業(yè)學(xué)院。本文件主要起草人：馬劍鋼、林鋒、唐標(biāo)、楊華、龍曉倩、吳靜、郝貴杰、黃愛霞、周冬仁、王雨辰、韓青松。1T/ZNZ251—2024淡水魚及其養(yǎng)殖水體中嗜水氣單胞菌的分離和藥敏試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了淡水魚及其養(yǎng)殖水體中嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila）的分離和藥敏試驗(yàn)方法相關(guān)的術(shù)語和定義、設(shè)備、試劑和材料、試驗(yàn)程序、樣品、分離培養(yǎng)、菌株確證、藥敏試驗(yàn)及生物安全的要求。本文件適用于淡水魚及其養(yǎng)殖水體中嗜水氣單胞菌的分離和藥敏試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T18652致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T28642飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法WS/T639抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求T/ZNZ044畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測方法中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部令第16號動(dòng)物病原微生物菌（毒）種保藏管理辦法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1藥敏試驗(yàn)antimicrobialsusceptibilitytesting在體外測定微生物對抗菌藥物敏感性的試驗(yàn)。3.2最低抑菌濃度minimalinhibitoryconcentration,MIC采用肉湯稀釋法等對微生物進(jìn)行藥物敏感性檢測試驗(yàn)，能抑制肉眼可見的細(xì)菌生長的最低抗菌藥物濃度。3.3折點(diǎn)breakpoint2T/ZNZ251—2024用于區(qū)分菌株為敏感、中介和耐藥的MIC值。4設(shè)備4.1超凈工作臺(tái)。4.2基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）。4.3核酸電泳儀。4.4凝膠成像系統(tǒng)。4.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）擴(kuò)增儀。4.6微量移液器：0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。4.7自動(dòng)加樣儀或多通道微量加樣器：10μL～100μL。4.8電子天平：感量0.001g。4.9麥?zhǔn)媳葷醿x：可測量范圍0.01～4.00麥?zhǔn)蠁挝弧?.10恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃,35℃±1℃。4.11低溫運(yùn)輸箱：2℃~8℃。4.12冰箱：2℃~8℃,-20℃,-80℃。5試劑和材料5.1試劑5.1.1生理鹽水：制備按附錄A中A.1執(zhí)行。5.1.2氨芐青霉素：純度大于98%。5.1.3氨芐青霉素儲(chǔ)液：按附錄A中A.2執(zhí)行。5.2培養(yǎng)基5.2.1氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板（McConkeyAgar）的制備按附錄A中A.3執(zhí)行。5.2.2RS瓊脂平板（Rimler-ShottsAgar）的制備按附錄A中A.4執(zhí)行。5.2.3普通營養(yǎng)瓊脂平板（NutrientAgar）的制備按附錄A中A.5執(zhí)行。5.2.4MH肉湯（Mueller-Hintonbroth）的制備按WS/T639執(zhí)行。5.3參考菌株5.3.1陽性對照菌株嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966，保存、傳代等應(yīng)按照GB4789.28執(zhí)行。5.3.2質(zhì)控菌株大腸埃希菌（Escherichiacoli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，保存、傳代等應(yīng)按照GB4789.28執(zhí)行。5.4材料5.4.1無菌培養(yǎng)皿：直徑60mm或90mm。5.4.2滅菌小試管：10mm×100mm。5.4.396孔透明無菌微孔板。5.4.4一次性無菌接種環(huán)：1μL和10μL。5.4.5無菌吸頭：10μL、200μL和1mL。3T/ZNZ251—20245.4.6無菌水樣采集袋、無菌采樣管；5.4.7細(xì)菌DNA提取試劑盒。5.4.8PCR擴(kuò)增試劑盒。5.4.9DNALadder。5.4.100.5×TAE電泳緩沖液。5.4.11標(biāo)準(zhǔn)比濁管。5.4.12商品化藥敏試驗(yàn)板。6試驗(yàn)程序分離和藥敏試驗(yàn)流程見圖1。 采集淡水魚糞便、組織及其環(huán)境水樣接種氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h 可疑菌落接種RS瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h～36h16SrDNA測序確證微生物質(zhì)譜確證 菌種保藏 藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告圖1嗜水氣單胞菌的分離和藥敏試驗(yàn)流程圖7樣品7.1采集7.1.1糞便在無菌條件下解剖取魚腸道，刮取直腸末端糞便，放入無菌采樣管中，標(biāo)記信息，密封后2℃~8℃冷藏保存。7.1.2組織在無菌條件下采集魚的病變部位（肌肉、肝、脾、腎、心等），放入無菌袋中，標(biāo)記信息，密封后2℃~8℃冷藏保存，具體操作應(yīng)按照GB/T18652執(zhí)行。7.1.3水樣用無菌水樣采集袋收集50mL水樣，標(biāo)記信息，密封后2℃~8℃冷藏保存。4T/ZNZ251—20247.2運(yùn)輸樣品按GB4789.1要求盡快運(yùn)達(dá)檢驗(yàn)單位，低溫運(yùn)輸箱應(yīng)保持清潔，運(yùn)輸過程中應(yīng)防止包裝破損導(dǎo)致樣品滲漏。確認(rèn)樣品完好后盡快進(jìn)行分離純化。8分離培養(yǎng)8.1氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)用一次性無菌接種環(huán)蘸取糞便或組織臟器表面，劃線于氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板上，28℃±1℃培養(yǎng)24h；將50mL水樣在4℃下4000g/min離心5min，棄去上清，用一次性無菌接種環(huán)蘸取沉淀，劃線于氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板上，28℃±1℃培養(yǎng)24h。邊緣整齊、光滑、無色或淡黃色的圓形菌落為嗜水氣單胞菌可疑菌落。8.2RS瓊脂平板培養(yǎng)挑取可疑菌落，劃線接種于RS瓊脂平板上，28℃±1℃培養(yǎng)24h～36h。菌落初期呈黃色，24h以后呈藍(lán)黑色的為嗜水氣單胞菌可疑菌落。9菌株確證9.1PCR確證9.1.1細(xì)菌DNA提取將嗜水氣單胞菌疑似菌落在普通營養(yǎng)瓊脂上劃線，35℃±1℃靜置培養(yǎng)，挑取單菌落采用煮沸法或選用試劑盒提取細(xì)菌DNA，具體操作應(yīng)按照GB/T28642的要求執(zhí)行。9.1.2PCR擴(kuò)增通過16SrDNA的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列和反應(yīng)條件按照附錄B執(zhí)行。9.1.3測序確證16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，在1500bp位置觀察到陽性條帶，將產(chǎn)物測序后與嗜水氣單胞菌的16SrDNA序列（AccessionNo.NR_074841.1）進(jìn)行比對，序列一致即可確證為嗜水氣單胞菌。9.2質(zhì)譜確證有條件的實(shí)驗(yàn)室可通過MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對嗜水氣單胞菌進(jìn)行確證，具體操作應(yīng)按照T/ZNZ044的要求執(zhí)行。9.3菌株保存分離確證后的嗜水氣單胞菌菌株保藏應(yīng)按照GB4789.28執(zhí)行。10藥敏試驗(yàn)10.1試驗(yàn)板準(zhǔn)備5T/ZNZ251—2024藥敏試驗(yàn)板抗菌藥物濃度范圍按照附錄C中C.1進(jìn)行稀釋，使用商品化藥敏試驗(yàn)板時(shí)，應(yīng)選擇革蘭氏陰性需氧菌藥敏試驗(yàn)板，并按照藥敏板說明書進(jìn)行操作。10.2菌液制備待測菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，35℃±1℃培養(yǎng)24h，連續(xù)培養(yǎng)2代，獲得活化后的純培養(yǎng)物。挑取3～4個(gè)單菌落轉(zhuǎn)移至2mL無菌生理鹽水中，用濁度儀測定并調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?≈1×108CFU/mL用MH肉湯稀釋100倍，混勻備用，制備的菌懸液應(yīng)在15min內(nèi)完成加樣。每一批次藥敏試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置質(zhì)控菌株作為對照，質(zhì)控菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，35℃±1℃培養(yǎng)12h～18h，連續(xù)培養(yǎng)2代，按照相同方法處理制備質(zhì)控菌懸液。10.3加樣每塊藥敏試驗(yàn)板應(yīng)設(shè)置陰性孔和陽性孔。陰性孔中加入無菌MH肉湯100μL，陽性孔（不含抗菌藥物）中加入制備好的100μL菌懸液，其余孔（含不同梯度的抗菌藥物）各加入制備菌懸液100μL，蓋上無菌蓋并標(biāo)記菌株編號和時(shí)間等信息。10.4培養(yǎng)加樣完成后置于35℃±1℃培養(yǎng)18h～20h。10.5MIC值判讀和記錄10.5.1取出藥敏試驗(yàn)板，在光線良好條件下用肉眼觀察結(jié)果。以肉眼可見抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。10.5.2如陰性孔未見渾濁且陽性孔渾濁，則該藥敏試驗(yàn)板結(jié)果有效，可進(jìn)行MIC結(jié)果的判讀。10.5.3質(zhì)控菌株判讀結(jié)果在MIC質(zhì)控范圍內(nèi)，則認(rèn)為該次藥敏試驗(yàn)有效。10.5.4在10.5.2和10.5.3同時(shí)有效的前提下，讀取和記錄每個(gè)菌的MIC值，若出現(xiàn)單個(gè)跳孔現(xiàn)象，可以忽略；出現(xiàn)兩個(gè)以上跳孔現(xiàn)象的，則該次藥敏試驗(yàn)無效，應(yīng)重新檢測。10.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)測試菌株的MIC值，按照附錄C中C.2氣單胞菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性，結(jié)果報(bào)告為敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）。對于沒有規(guī)定折點(diǎn)的藥物，報(bào)告其MIC值。11生物安全11.1開展細(xì)菌分離與藥敏試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)符合GB4789.1、GB19489生物安全要求。11.2廢棄物處理應(yīng)按照GB19489執(zhí)行。11.3菌株管理按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部令第16號文件中動(dòng)物病原微生物菌（毒）種保藏管理辦法相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。6T/ZNZ251—2024A.1生理鹽水稱取0.85g氯化鈉（分析純）溶于一定量的蒸餾水中，完全溶解后定容至100mL，121℃高壓滅菌15min。A.2氨芐青霉素儲(chǔ)液稱取1.0g氨芐青霉素粉末，溶于10mL蒸餾水中，配置成100mg/mL的氨芐青霉素儲(chǔ)液，用0.22μm濾膜過濾除菌。A.3氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板按照表A.1稱取各組分，溶解于800mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至1000mL,加入中性紅0.03g和結(jié)晶紫0.001g，121℃高壓滅菌15min。冷卻至50℃~55℃,加入200μL氨芐青霉素儲(chǔ)液，氨芐青霉素終濃度為20μg/mL，傾注無菌培養(yǎng)皿中。表A.1氨芐青霉素麥康凱瓊脂平板成分A.4RS瓊脂平板按照表A.2稱取各組分，溶于800mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1000mL，煮沸1min，冷卻至50℃~55℃,傾注無菌培養(yǎng)皿中。表A.2RS瓊脂平板成分7T/ZNZ251—2024A.5普通營養(yǎng)瓊脂平板按照表A.3稱取各組分，溶解于800mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.3，定容至1000mL,121℃高壓滅菌15min。冷卻至50℃~55℃,傾注無菌培養(yǎng)皿中。表A.3普通營養(yǎng)瓊脂平板成分8T/ZNZ251—2024PCR引物及條件B.1PCR引物嗜水氣單胞菌16SrDNA引物序列見表B.1。表B.1嗜水氣單胞菌PCR引物AGAGTTTGATCATGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTTB.2PCR反應(yīng)條件B.2.1PCR程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性20s；72℃延伸5min。B.2.2PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系為30μL：15μL2×TaqPCRMix，1μL引物F（10μM），1μL引物R（10μM），12μLddH2O，每個(gè)體系含1μLDNA模板。9T/ZNZ251