HPLC-UV測(cè)定加替沙星的血藥濃度

HPLC-UV測(cè)定加替沙星的血藥濃度背景1.高效液相色譜：高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)：①高壓輸液泵：驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過(guò)色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng)；②色譜柱：分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)；③進(jìn)樣器：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；④檢測(cè)器：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào)；⑤餾分收集器：為做其它波譜鑒定或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，進(jìn)行餾分收集；⑥數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)：把檢測(cè)器檢測(cè)到的信號(hào)顯示出來(lái)。2.加替沙星是又一新型氟哇諾酮的C位用3一甲基呱嗓基取代的衍生物。具有抗菌譜廣,抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)。加替沙星對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、厭氧菌、需氧菌及非典型致病原均有較強(qiáng)的活性，同時(shí)又具有口服吸收好,體內(nèi)分布廣,光毒性小等特點(diǎn)。二、目的掌握如何利用高效液相的方法測(cè)定家兔血清中加替沙星血漿藥物濃度。研究注射液加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。三、材料儀器：高效液相色譜儀、離心機(jī)、渦旋振蕩儀；試劑：烏拉坦、加替沙星注射液、空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)液、10%高氯酸溶液，所用溶液均為分析純。四、方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：取健康家兔，稱重，耳緣靜脈注射烏拉坦（5ml/kg）麻醉，固定。耳緣靜脈注射加替沙星注射液（30ml/kg），給藥停止后分別于2,5,10,15,30,45,60,90,120min時(shí)進(jìn)行血液樣本采集，每次取血0.5ml，所用方法為股動(dòng)脈取血，所取血液樣本裝入無(wú)菌微量離心管。色譜條件：色譜柱：ZORBAXExtend-C184.6×150mm；流動(dòng)相：甲醇：0.05mol/L檸檬酸=25:75（pH=3）；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：293nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：無(wú)菌微量離心管中加入空白血漿90μL、標(biāo)準(zhǔn)液10μL、10%高氯酸溶液100μL，渦旋振蕩3min，然后12000rpm離心10min，取上清液120μL。取20μL上清液進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取100μL樣品，加入100μL高氯酸溶液，剩余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線，以取血時(shí)間為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作樣本學(xué)藥濃度曲線。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線血藥濃度曲線時(shí)間（min）25101530456090120面積515464385129268089200687129184105598822586291446352濃度（μg/ml)38.4828.6619.84714.7699.3837.6064.9094.39093.143濃度對(duì)數(shù)1.5852350631.4572761861.297694871.169351090.9723417160.8811563210.6909930320.6425535460.497344381藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算：由濃度時(shí)間曲線推斷為房二室模型由濃度對(duì)數(shù)時(shí)間曲線得：分布速率常數(shù)α=0.0818lgA=1.6481藥物的分布半衰期t1/2α=7.81min消除速率常數(shù)β=0.0074lgB=0.9008藥物的消除半衰期t1/2β=86.35min=1.43h初始血藥濃度C0=38.48(μg/mＬ)血藥濃度－時(shí)間曲線下總面積AUC=41格*20μg/mＬ·min=13.67(μg/mＬ·h)Vd=(30mg/kg)*(2kg)/38.48(μg/mＬ)=1.559LCL=0.692(Ｌ/h)MRT=1/0.0074=135.13min六、討論.采血：每只兔耳耳緣靜脈有兩條，采血前均應(yīng)備齊，以免采血時(shí)不慎將血管破壞后不能及時(shí)采血；采集血樣時(shí)應(yīng)從耳尖向耳根方向依次取血，如任意采血，后幾個(gè)點(diǎn)因血管被破壞無(wú)法采到；每次采血時(shí)應(yīng)先使其劇烈運(yùn)動(dòng)，加速血液循環(huán)，便于采血；采血還應(yīng)注意取血手法，應(yīng)用中指墊住耳背，食指與無(wú)名指確定采血曲間，快而穩(wěn)的進(jìn)針，抽血時(shí)要慢，因耳緣靜脈血管較細(xì)，如抽血過(guò)快血管易抽癟，無(wú)法采血。樣品處理：甲醇與乙腈是反相液相色譜法中常用的蛋白沉淀劑，因?yàn)樗鼈兣c流動(dòng)相的組成相同。甲醇沉淀蛋白的優(yōu)點(diǎn)是上清液清澈，沉淀為絮狀易于分離；乙腈與之相反，產(chǎn)生細(xì)的蛋白沉淀，但沉淀效率較甲醇高。因本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相選擇甲醇且取上清液，故選用甲醇沉淀蛋白。通過(guò)查找文獻(xiàn)，加替沙星靜脈滴注1h左右達(dá)血藥濃度峰值，在推薦劑量范圍內(nèi)加替沙星血藥濃度峰值和曲線下面積隨劑量成比例增加。本藥口服與靜脈注射生物等效，口服絕對(duì)生物利用度約為96%，且靜脈注射后1h的藥動(dòng)學(xué)與口服等劑量片劑相同，即靜脈注射和口服兩種給藥方式可交替使用。加替沙星與蛋白結(jié)合率約為20%，與濃度無(wú)關(guān)。藥物廣泛分布于組織和體液中。本藥無(wú)酶誘導(dǎo)作用，不改變自身和其他合用藥物的清除代謝，且在體內(nèi)代謝極低，主要以原形經(jīng)腎臟排出。pH值的影響：pH值對(duì)保留時(shí)間和分離效果影響較大?？疾煸?.0，3.5，4.0，5.0分離效果，隨著pH值的增大，保留時(shí)間延長(zhǎng)，且不能完全分離環(huán)丙沙星和洛美沙星，而當(dāng)pH值在3.5，3.0時(shí)分離較好，但pH=3.0時(shí)對(duì)色譜柱壽命有影響，所以選用pH=3.5。柱溫的影響：考察了常溫，20℃，30℃，40℃，45℃5種溫度，溫度越高，出峰越快，且柱效高，但高于40℃后變化不大，且對(duì)色譜柱壽命有影響，故本實(shí)驗(yàn)柱溫定為40℃。關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①加替沙星是第4代氟喹諾酮類抗生素,廣泛應(yīng)用于革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌、衣原體、支原體等病原體引起的感染。本實(shí)驗(yàn)建立用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定加替沙星血藥濃度方法,為臨床合理用藥提供參考；②由血藥濃度時(shí)間曲線判斷為房二室模型；③根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分布半衰期為7.81min，表明靜注加替沙星后7-8min就可分布在家兔體內(nèi)各組織中，且分布量高，具有很高的抗菌濃度；④消除半衰期為1.43h，表明靜注加替沙星后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，各組織仍有較高的抗菌濃度；⑤根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，半衰期數(shù)據(jù)比較符合文獻(xiàn)的資料，說(shuō)明藥物代謝比較接近正常的情況；⑥根據(jù)表觀分布容積，可看出藥物基本分布在血液。關(guān)于實(shí)驗(yàn)操作：①在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣之前，需用甲醇沖洗色譜柱；