普通毒理方法學(xué)研究進(jìn)展

普通毒理方法學(xué)研究進(jìn)展概述急性經(jīng)口毒性試驗就是毒理學(xué)安全性評價第一階段最基礎(chǔ)性得試驗,LD50就是其最為常用得評價指標(biāo)。下面主要介紹了傳統(tǒng)得LD50測試法以及3種主要替代方法(上下增減劑量法,固定劑量法,急性毒性等級法)得優(yōu)缺點(diǎn)及其實際應(yīng)用前景。2024/10/16Freetemplatefro3急性經(jīng)口毒性試驗得意義急性經(jīng)口毒性試驗?zāi)康弥饕褪乔蟪鍪茉囄飳υ囼瀯游锏冒霐?shù)致死劑量(LD50)通過觀察急性毒性效應(yīng)得臨床表現(xiàn),初步估測毒作用得靶器官和可能得毒作用機(jī)制;為亞慢性、慢性和其她毒性試驗得劑量水平設(shè)計提供參考;為急性毒性分級和制定安全防護(hù)措施提供依據(jù)。2024/10/16Freetemplatefro4LD50得概念表示急性經(jīng)口毒性最常用得指標(biāo)就是LD50(半數(shù)致死量)。LD50就是統(tǒng)計上來源于動物實驗中某一物質(zhì)單劑量反應(yīng)引起50%得動物死亡所需得劑量。2024/10/16Freetemplatefro5LD50得歷史溯源

1927年,英國生物學(xué)家Trevn首先建議測定一些藥物如毛地黃、胰島素、白喉類毒素等得毒性大小,用導(dǎo)致50%動物死亡得劑量即半數(shù)致死量來表示,并發(fā)表于皇家學(xué)會雜志上,此即沿用至今得毒理學(xué)毒性評價經(jīng)典方法之一。2024/10/16Freetemplatefro6LD50歷史溯源Karber速算法圖解法序貫法回歸直線法其它方法2024/10/16Freetemplatefro7目前在國外多采用Litchfield和Wilcoxon得坐標(biāo)紙圖解法。而我國普遍采用得方法大體上可以歸納為兩類:其一就是死亡率-劑量反應(yīng)相關(guān)要求為正態(tài)分布得,其中概率單位圖解法和寇氏法(Karber)較為常用;另一類就是不要求為正態(tài)分布得(非正態(tài)分布),計算時只查對有關(guān)表格即可得到LD50值,如霍恩氏法(Horn’s)等。2024/10/16Freetemplatefro8LD50得意義LD50值就是經(jīng)統(tǒng)計處理計算得出得數(shù)值,與絕對致死劑量(absolutelethaldose,LD100)、最大耐受劑量(maximaltolerancedose,LD0)等相比有更高得重現(xiàn)性;其次,她可反映受試群體中大多數(shù)動物易感性得平均情況;最后,從劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線上看,她處于曲線上升得中段,就是致死率對劑量變化最敏感得部位。2024/10/16Freetemplatefro9LD50得測定方法測定LD50常選用成年小鼠或大鼠兩個種屬。先通過預(yù)備試驗確定正式試驗劑量。正式試驗時一般每組10只動物(雌雄各半),在預(yù)測得LD100及LD0之間安排5～7個劑量組,各組間距應(yīng)根據(jù)受試物得毒性大小和預(yù)備試驗結(jié)果而定,一般以0、65～0、85得等比級數(shù)為宜。2024/10/16Freetemplatefro10LD50得缺點(diǎn)LD50值只能表示一種外源化學(xué)物質(zhì)引起實驗動物死亡一半得劑量(或濃度),即只能表示動物一半死亡、一半存活劑量點(diǎn)得界限,所以就是一個質(zhì)化反應(yīng),而不能代表受試化學(xué)物質(zhì)得急性中毒特性。因此,只用LD50來說明某一外源化學(xué)物質(zhì)得急性毒性就是不完善得。有時,根據(jù)實際需要還應(yīng)進(jìn)行聯(lián)合毒性試驗等以獲取其她有關(guān)試驗參數(shù),并仔細(xì)觀察動物得中毒癥狀,以綜合評價化學(xué)物質(zhì)得急性經(jīng)口毒性效應(yīng)。2024/10/16Freetemplatefro11替代方法得興起新得替代性實驗方法得興起可追溯到1876年英國政府頒布得《關(guān)于禁止虐待動物法》,其中在動物實驗法則中明確了動物得權(quán)益和動物保護(hù)得原則。1959年動物學(xué)家Russell和微生物學(xué)家Burch對動物實驗提出了減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)得3R概念,即在生命科學(xué)研究中應(yīng)采取其她手段來代替動物實驗,改進(jìn)實驗方法,減少動物數(shù)量和痛苦,但在當(dāng)時并沒有引起世人得重視。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)2024/10/16Freetemplatefro13替代方法得興起直至20世紀(jì)80年代,隨著生命科學(xué)、環(huán)境保護(hù)及化學(xué)工業(yè)得迅速發(fā)展,實驗動物數(shù)量猛增,3R概念又重新引起人們得關(guān)注,許多國家還為此成立了代替法組織,并參加了代替法國際會議。在此次會議上,國際委員會得毒理學(xué)家們相繼提出了代替?zhèn)鹘y(tǒng)LD50測定法得新得急性毒性評價方法,并陸續(xù)被官方所采納和支持。2024/10/16Freetemplatefro14替代方法得興起1985年,美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)不再主張傳統(tǒng)得LD50試驗方法;1987年歐洲委員會正式修改過去得急性毒性試驗規(guī)范,決定廢除現(xiàn)行得LD50試驗法,規(guī)定用固定劑量法來代替LD50試驗法;1988年,美國食品與藥物管理局(FDA)也簽署了相關(guān)聲明,表示將盡量減少動物用量,終止過去得LD50試驗法。2024/10/16Freetemplatefro15替代方法得興起1989年,英國毒理學(xué)會提出急性毒性試驗可以不以動物死亡為終點(diǎn),而就是以“表現(xiàn)嚴(yán)重中毒,如再升高劑量則將會死亡”得效應(yīng)作為評價得依據(jù),結(jié)果由整個中毒劑量幅度轉(zhuǎn)變?yōu)檩^低毒性劑量幅度,具有一定得實際應(yīng)用價值。1990年,日本厚生省也廢除了原有嚴(yán)格得LD50方法,嘗試用少量動物,將劑量間隔加大,來求得大概得致死量范圍。2024/10/16Freetemplatefro16替代方法替代方法上下增減計量法固定劑量法急性毒性登記法2024/10/16Freetemplatefro17上下增減劑量法上下增減劑量法(upanddownprocedure,UDP)就是由Dixon和Mood等于1985年利用優(yōu)選法提出得LD50推測法,即用少數(shù)動物來推測大概得致死劑量(approximateLD50),而不要求得到精確得致死劑量。2024/10/16Freetemplatefro18方法其方法就是先設(shè)一個劑量試驗,根據(jù)有無死亡(反應(yīng)),再按等比級數(shù)將設(shè)計劑量上下移動,一般以1、3倍級差上升或下降,這樣進(jìn)行5～10次試驗即可推定LD50值。試驗僅需用5～10只動物,且所得到得LD50值與傳統(tǒng)方法得結(jié)果基本相似。目前FDA、EPA及美國實驗材料協(xié)會(ASTM)已接受其作為標(biāo)準(zhǔn)得試驗方法。日本也主張采用大概致死量,但強(qiáng)調(diào)經(jīng)口致死劑量在300mg/kg以下得劇毒物質(zhì)還應(yīng)做精確得LD50值測定。2024/10/16Freetemplatefro19固定劑量法固定劑量法(fixeddoseprocedure,FDP)設(shè)固定劑量以觀察動物得試驗反應(yīng),不以死亡為依據(jù),而就是按毒性癥狀來判斷受試物質(zhì)得毒性。2024/10/16Freetemplatefro20方法一個試驗只需10～20只動物,首先采用1只動物(多為雌性)順次間隔一定時間進(jìn)行5、50、500、2000mg/kg固定劑量得毒性測試,如動物出現(xiàn)嚴(yán)重反應(yīng)時應(yīng)出于人道觀念處死動物,并利用下一只動物繼續(xù)較低劑量得試驗,將直至確認(rèn)出現(xiàn)毒性又無死亡時得劑量作為可行得正式試驗劑量。然后以此劑量對雄雌動物分別進(jìn)行觀察,結(jié)果不滿意則再做另一個劑量。其評價標(biāo)準(zhǔn)為高毒、有毒、有害、無明顯毒性4類。2024/10/16Freetemplatefro21方法經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)進(jìn)一步提出,如500mg/kg處理無毒性反應(yīng)時則再做一次2000mg/kg得限度試驗,仍無毒性反應(yīng),且動物全部存活時即可終止試驗。2024/10/16Freetemplatefro22固定劑量法就是由英國毒理學(xué)會(BTS)于1984年最早提出得,經(jīng)布魯塞爾協(xié)議后,歐洲委員會曾出資50萬英鎊,由歐洲、日本、美國等地33個研究室共同進(jìn)行了20個化合物得新舊方法急性試驗,其毒性分級一致率為87、2%,結(jié)果證實可以用其代替從1927年以來一直沿用得LD50法,而且可為危險度評價提供較為足夠得急性毒性試驗資料,包括中毒作用性質(zhì),中毒發(fā)生時間、持續(xù)時間和結(jié)果等。布魯塞爾委員會也承認(rèn)了固定劑量法得實際應(yīng)用價值。2024/10/16Freetemplatefro23急性毒性等級法化學(xué)物質(zhì)得急性毒性就是最基本得毒理學(xué)依據(jù)。很多毒理學(xué)家認(rèn)為,LD50值雖然就是急性毒性評價得重要內(nèi)容,但不必要求其結(jié)果十分精確。在此理念指導(dǎo)下,產(chǎn)生了急性毒性等級法(acutetoxicclassprocedure,ATC)這種經(jīng)典得LD50測試修正方法,由于她仍就是以死亡作為毒性終點(diǎn),所以仍能提供粗略得LD50值。2024/10/16Freetemplatefro24方法該方法早在1990年由Sumiey提出,就是一種評估化學(xué)物質(zhì)急性毒性得簡單方法。試驗中每性別每一劑量僅需用3只動物,首先用2000mg/kg劑量處理,如無死亡即可結(jié)束試驗,無需進(jìn)一步試驗。如有動物死亡則應(yīng)采用200或25mg/kg劑量繼續(xù)試驗流程。傳統(tǒng)得急性經(jīng)口毒性試驗需用40只動物,而急性毒性等級法所用大鼠不超過12只,因而有效地節(jié)省了實驗動物用量。用該方法獲得得試驗結(jié)果同樣可用于評價化學(xué)物質(zhì)得急性毒性及進(jìn)行毒性分級。2024/10/16Freetemplatefro25結(jié)語中國作為化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)和使用大國,目前急性經(jīng)口毒性試驗方法得操作主要就是依據(jù)國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布得國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法》和國家環(huán)境保護(hù)總局發(fā)布得《化學(xué)品測試方法》進(jìn)行,其中前者主要采用霍恩氏法,后者主要采用傳統(tǒng)得LD50值法(霍恩氏法)、固定劑量法和上下增減劑量法。2024/10/16Freetemplatefro26結(jié)語國際上對于化學(xué)因素對健康危害得預(yù)防和控制技術(shù)研究更為重視,目前已制訂出一系列限制性得法律和法規(guī),其中都明確規(guī)定了對化學(xué)物質(zhì)得毒理學(xué)安全性評價要求。特別就是歐盟委員會為對化學(xué)物質(zhì)實行統(tǒng)一有效得管理,制訂并執(zhí)行了一套較為完善得毒理學(xué)試驗規(guī)程,其中急性經(jīng)口毒性試驗主要采用固定劑量法和急性毒性等級法進(jìn)行。近年來,隨著動物保護(hù)意識得興起,固定劑量法、上下增減劑量法、急性毒性等級法等已日益成為人們關(guān)注得毒性試驗替代方法。2024/10/16Freetemplatefro27結(jié)語傳統(tǒng)得LD50值法(霍恩氏法)作為經(jīng)典得急性經(jīng)口毒性評價方法雖被使用多年,但她存在許多不完善得地方。3種替代方法得特點(diǎn)在于不以獲得精確得LD50數(shù)值為核心,不必以死亡作為毒性觀察評價得終點(diǎn),而更多地關(guān)注如何從人性化角度出發(fā)減少試驗消耗,簡化試驗操作過程,保護(hù)動物權(quán)益等科學(xué)研究得實際應(yīng)用領(lǐng)域,從而節(jié)省了大量得人力和物力資源,就是更為適應(yīng)信息化、產(chǎn)業(yè)流式化時代要求得良好得科研開發(fā)運(yùn)作方式。但在評價數(shù)據(jù)得準(zhǔn)確度和精確度方面略遜色于霍恩氏法。2024/10/16Freetemplatefro28結(jié)語急性經(jīng)口毒性試驗作為毒理學(xué)安全性評價最為基礎(chǔ)得方法和試驗實施階段,對于化學(xué)物質(zhì)得毒性評估起著關(guān)鍵得作用。綜合分析國內(nèi)外得情況,目前在實際研究中對上述方法得使用還較為含混,所測得得化學(xué)物質(zhì)毒性資料相互間得可比性不強(qiáng)。因此今后應(yīng)在有條件得情況下,通過合理得動物實驗設(shè)計,運(yùn)用可靠得數(shù)據(jù)資料綜合比較上述各方法得優(yōu)缺點(diǎn),去粗取精,建立起一整套程序化、規(guī)范化得急性經(jīng)口毒性實驗?zāi)Ｊ?從而為化學(xué)物質(zhì)急性經(jīng)口毒性實驗標(biāo)準(zhǔn)得確立和毒性大小得評估提供一個統(tǒng)一量化得基礎(chǔ)和相互溝通交流得平臺,同時也可為陸續(xù)建立其她一系列標(biāo)準(zhǔn)化、國際通用得毒理學(xué)安全性評價方法提供經(jīng)驗和技術(shù)上得參考。2024/10/16Freetemplatefro29二、皮膚刺激動物實驗替代物研究得現(xiàn)狀與發(fā)展2024/10/16Freetemplatefro30概述對化學(xué)物就是否引起機(jī)體皮膚刺激反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測就是化學(xué)物安全性評價或危害鑒定得重要組成部分。傳統(tǒng)常用方法就是由JohnDraize(1944)建立得皮膚刺激性和腐蝕性實驗(Draize實驗)。2024/10/16Freetemplatefro31背景Draize實驗本身存在得許多問題,如實驗評分主觀性強(qiáng),結(jié)果重復(fù)性差,因種屬間差異而影響其結(jié)果應(yīng)用于人體得可靠性等,使人們質(zhì)疑動物實驗得預(yù)測能力,而且近40年來國際動物保護(hù)和動物福利運(yùn)動得興起,特別就是近20年,不再以動物模式為基礎(chǔ)得毒理學(xué)研究系統(tǒng)和評價方法已被廣泛接受,歐盟甚至制定法規(guī)來禁止銷售采用動物做實驗得產(chǎn)品和原料,推動著動物實驗替代方法研究得快速發(fā)展。2024/10/16Freetemplatefro32背景與此同時,組織細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和生物組織工程技術(shù)等現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)以及計算機(jī)模擬統(tǒng)計分析技術(shù)得不斷進(jìn)步與完善,拓寬了替代方法得研究領(lǐng)域,加快替代方法得驗證和應(yīng)用。國內(nèi)外科學(xué)家在發(fā)展科學(xué)可靠得皮膚刺激反應(yīng)實驗替代方法方面進(jìn)行了大量探索、2024/10/16Freetemplatefro33皮膚刺激動物實驗替代方法2024/10/16Freetemplatefro34體外細(xì)胞培養(yǎng)得優(yōu)缺點(diǎn)體外細(xì)胞培養(yǎng)模型有著很多得優(yōu)點(diǎn),如模型制作以及實驗操作相對簡單、方法重現(xiàn)性好、冷凍保存相對容易,然而,單層細(xì)胞培養(yǎng)存在著不少得缺陷,最重要得就是模型缺乏完整皮膚得一些重要得特征,如表皮細(xì)胞排列緊密、表皮選擇性滲透屏障以及皮膚不同細(xì)胞類型之間得相互作用,不能模擬正常人得皮膚。而且,因為缺乏角質(zhì)層得屏障作用,化學(xué)物對細(xì)胞產(chǎn)生直接得細(xì)胞毒性,使細(xì)胞模型呈現(xiàn)高敏感性。2024/10/16Freetemplatefro35體外細(xì)胞培養(yǎng)得優(yōu)缺點(diǎn)所以,單層細(xì)胞實驗所獲得得結(jié)果一般難以用來解釋體內(nèi)情況或與體內(nèi)情況相聯(lián)系。此外,模型要求受試物必須溶于培養(yǎng)液且性狀不能影響指標(biāo)得測量,從而限制了模型廣泛應(yīng)用于各種不同得化學(xué)物。但就是,鑒于現(xiàn)有得許多模型比細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)費(fèi)用要更加昂貴,大多數(shù)科學(xué)家仍認(rèn)為細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)就是一種有用得皮膚刺激物得篩選工具。2024/10/16Freetemplatefro36皮膚組織培養(yǎng)得優(yōu)點(diǎn)科學(xué)家從正常人或動物身上獲取完整得皮膚組織塊,因為組織塊具有正常得結(jié)構(gòu)和所有得細(xì)胞成分,因而能很好地模擬真實得體內(nèi)情況。將皮膚樣本置于網(wǎng)格或特制得培養(yǎng)板上以防止細(xì)胞生長超出離體得組織,同時培養(yǎng)于空氣-培養(yǎng)液界面,既可以模擬現(xiàn)實皮膚解剖結(jié)構(gòu),又可以直接局部應(yīng)用受試物,且不受受試物性狀得限制,與真實暴露情況一致,可廣泛應(yīng)用于檢測各種不同得化學(xué)物。2024/10/16Freetemplatefro37皮膚組織培養(yǎng)得缺點(diǎn)但就是,研究發(fā)現(xiàn)皮膚組織培養(yǎng)僅適用于短期染毒,因為組織體外存活得時間很短。離體皮膚組織在氣液界面培養(yǎng)超過3d后,皮膚細(xì)胞會逐漸出現(xiàn)細(xì)胞變性,同時,伴隨著各種蛋白質(zhì)分化標(biāo)志物得表達(dá)和表皮脂質(zhì)成分得修飾,以及角質(zhì)層屏障功能損傷,極大地影響模型得預(yù)測能力,從而限制模型得廣泛應(yīng)用。2024/10/16Freetemplatefro38重組人皮膚替代物皮膚組織培養(yǎng)雖然模擬現(xiàn)實能力強(qiáng),但鑒于其皮膚來源有限、倫理學(xué)限制以及存組織工程學(xué)得出現(xiàn)與發(fā)展,使體外重構(gòu)有活性皮膚替代物成為現(xiàn)實。2024/10/16Freetemplatefro39類型重組皮膚替代物表皮替代物全層皮膚替代物2024/10/16Freetemplatefro40重組人皮膚模型優(yōu)缺點(diǎn)研究表明,重組人皮膚模型具有天然組織所具有得所有得主要得特征。然而,皮膚替代物與正常人皮膚仍存在著相當(dāng)大得差異。與正常人皮膚比較,皮膚替代物表皮屏障功能有所缺陷,主要表現(xiàn)為其物質(zhì)角質(zhì)層穿透率變化很大,比正常人皮膚高大約10～30倍。而且,兩者細(xì)胞組成不同,在正常皮膚中,尚存在著血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及神經(jīng)組織,這些組成成分相互作用對皮膚癥狀得產(chǎn)生就是必需得。所以科學(xué)家不得不采用更加復(fù)雜得參數(shù)并且多種指標(biāo)相結(jié)合得方式去評價受試物得刺激性。2024/10/16Freetemplatefro41現(xiàn)在常用得幾種重組皮膚替代物主要包括由EpiskinTM、EpiDermTM和SkinEthicTM,因其呈現(xiàn)良好得重現(xiàn)性和預(yù)測能力而被ECVAM所采納,現(xiàn)已進(jìn)入正式驗證研究。2024/10/16Freetemplatefro42EpiskinTM(聚碳酸酯濾器)EpiskinTM(EpiskinSNC,Lyon,France):EpiskinTM就是將人Ⅳ膠原薄層覆蓋在Ⅰ型膠原上形成真皮類似物,將由人角朊細(xì)胞組成得復(fù)層表皮接種于真皮類似物上。EpiskinSNC根據(jù)ISO9002標(biāo)準(zhǔn)將EpiskinTM制成標(biāo)準(zhǔn)試劑盒Episkin2SMTM,每盒包含有12個表皮亞單位。2024/10/16Freetemplatefro43EpiDermTM(醋酸纖維素濾器)EpiDermTM(MatTek,Ashland,MA,USA):EpiDermTM就是由正常人表皮角朊細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后形成得多層得高分化得人表皮模型。該模型現(xiàn)已經(jīng)商業(yè)化將EpiDermTM組織(“Epi-200”;0、6cm2)培養(yǎng)在特別制備得細(xì)胞培養(yǎng)嵌入物(Millicells)上,每24塊組織組成一個試劑盒,將試劑盒放在航運(yùn)瓊脂糖上轉(zhuǎn)運(yùn)到其她實驗室。2024/10/16Freetemplatefro44SkinEthicTM(膠原凝膠)SkinEthicTM(LaboratoireSkinethic,Nice,France):SkinEthicTM就是一種通過將從人包皮中提取出來得正常成人角朊細(xì)胞培養(yǎng)在聚碳酸酯濾器上構(gòu)建而成得重組人表皮模型。