臨床免疫學檢驗名詞解釋重要知識點

抗原抗體反應：是指抗原和相應抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應?？乖贵w間結(jié)合力涉及靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水作用力，其中疏水作用力最強，它是在水溶液中兩個疏水基團相互接觸，由于對水分子排斥而趨向聚集力。親和性（affinity）：是指抗體分子上一個抗原結(jié)合點和一個相應抗原表位（AD）之間結(jié)合強度，取決于兩者空間結(jié)構互補程度。親合力（avidity）：是指一個完整抗體分子抗原結(jié)合部位和若干相應抗原表位之間結(jié)合強度，它和親和性、抗體結(jié)合價、抗原有效AD數(shù)目有關。抗原抗體反應特點：特異性、可逆性、比例性、階段性。帶現(xiàn)象（zonephenomenon）：一種抗原-抗體反應現(xiàn)象。在凝集反應或沉淀反應中，由于抗體過?；蚩乖^剩，抗原和抗體結(jié)合但不能形成大復合物，從而不出現(xiàn)肉眼可見反應現(xiàn)象。抗體過量稱為前帶，抗原過量稱為后帶。免疫原（immunogen）：是指能誘導機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞抗原。免疫佐劑（immunoadjustvant）：簡稱佐劑，是指某些預先或和抗原同時注入體內(nèi)，可增強機體對該抗原免疫應答或改變免疫應答類型物質(zhì)。半抗原（hapten）：又稱不完全抗原，是指僅具有和抗體結(jié)合能力(抗原性)，而單獨不能誘導抗體產(chǎn)生（無免疫原性）物質(zhì)。當半抗原和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后即可成為完全抗原。載體（carrier）：結(jié)合后能給予半抗原以免疫原性物質(zhì)。載體效應：初次免疫和再次免疫時，只有使半抗原結(jié)合在同一載體上，才能使機體產(chǎn)生對半抗原免疫應答，該現(xiàn)象稱為~。單克隆抗體（McAB）：將單個B細胞分離出來，加以增殖形成一個克隆群落，該B細胞克隆產(chǎn)生針對單一表位、結(jié)構相同、功能均一抗體，即~。多克隆抗體（PcAb）：天然抗原分子中常含多種不同抗原特異性抗原表位，以該抗原物質(zhì)刺激機體免疫系統(tǒng)，體內(nèi)多個B細胞克隆被激活，產(chǎn)生含有針對不同抗原表位免疫球蛋白，即~基因工程抗體（GEAb）：是利用DNA重組及蛋白工程技術，從基因水平對編碼抗體基因進行改造和裝配，經(jīng)導入適當受體細胞后重新表達抗體。雜交瘤技術【原理】以聚乙二醇（PEG）為細胞融合劑，使免疫后能產(chǎn)生抗體小鼠脾細胞和能在體外長期繁殖小鼠骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生雜交瘤細胞，通過次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）選擇性培養(yǎng)基作用，只讓融合成功雜交瘤細胞生長，經(jīng)反復免疫學檢測篩選和單個細胞培養(yǎng)（克隆化），最終獲得機能產(chǎn)生所需單克隆抗體又能長期體外繁殖雜交瘤細胞系。將這種細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，可從小鼠腹水中得到高效價單克隆抗體。（一）小鼠骨髓瘤細胞理想骨髓瘤細胞條件：①細胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；②細胞株本身不產(chǎn)生免疫球蛋白或細胞因子；③該細胞是HGPRT或TK缺陷株；④能和B細胞融合成穩(wěn)定雜交瘤細胞；⑤融合率高。目前最常用是NS-1和SP2/O細胞株（二）免疫脾細胞多采用和骨髓瘤細胞同源純系BALB/c小鼠；免疫途徑多為腹腔內(nèi)或皮內(nèi)多點注射法。若抗原微量，可用脾臟內(nèi)直接注射法進行免疫。細胞性抗原不需加佐劑，可溶性抗原需加完全弗氏佐劑。（三）細胞融合是產(chǎn)生雜交瘤細胞中心環(huán)節(jié)。一般用分子量1000D、1500D、4000DPEG作細胞融合劑，濃度30~50%之間，基本方法是將骨髓瘤細胞和脾細胞按1:2~1:10比例混合，加入PEG，誘導兩種細胞融合，時間控制在2min以內(nèi)，再加入培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG融合液，直至失去融合作用，融合細胞形成具有兩個或多個核異核體，最終產(chǎn)生雜交細胞。（四）雜交瘤細胞選擇性培養(yǎng)腫瘤細胞合成DNA有兩條途徑：一條為生物合成途徑，可被葉酸拮抗物（氨基蝶呤）阻斷；另一條為替代途徑，葉酸代謝受阻時，細胞通過HGPRT和TK，利用核苷酸前體物合成核苷酸，進而合成DNA。HAT培養(yǎng)液含三種成分：次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后，只有具備兩親本細胞雙重特性雜交瘤細胞能長期生存并產(chǎn)生抗體，成為制造單克隆抗體細胞源。細胞類型正常培養(yǎng)細胞TK缺陷細胞HGPRT缺陷細胞雜交瘤細胞正常培養(yǎng)基

+

+

+

+HAT培養(yǎng)基

+

-

-

+凝集反應（agglutinationreaction）：是指細菌和紅細胞或紅細胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）顆粒性載體和相應抗體（或抗原）特異性結(jié)合后，在適當電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象。①直接~：在適當電解質(zhì)參和下，細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原直接和相應抗體結(jié)合后出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象，稱為~。②間接~：可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小顆粒性載體（如正常人O型紅細胞、細菌、膠乳顆粒等）表面，然后和相應抗體（抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在條件下出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為~。其敏感度高于直接凝集反應和沉淀反應。正向間接凝集反應：用可溶性抗原致敏載體以檢測標本中待檢抗體。反向間接凝集反應：用特異性抗體致敏載體以檢測標本中待檢抗原。間接凝集抑制反應：用抗原致敏載體顆粒及相應抗體作為診斷試劑，檢測標本中是否存在和致敏抗原相同抗原。間接血凝試驗：是以紅細胞為載體間接凝集試驗，即用已知抗原（或抗體）致敏紅細胞，和標本中相應抗體（或抗原）特異結(jié)合，出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。膠乳凝集抑制試驗（LAT）：將抗原（或抗體）致敏膠乳顆粒，直接和待檢標本中抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應。（常用載體顆粒為聚苯乙烯膠乳）直接coombs試驗：將抗人球蛋白試劑直接加到表面結(jié)合抗體受檢紅細胞中，即可見細胞凝集。用于檢測吸附于紅細胞表面不完全抗體。（如HDN、AIHA）間接coombs試驗：將受檢血清和具有相應抗原性紅細胞相結(jié)合，再加入抗人球蛋白抗體即可出現(xiàn)可見紅細胞凝集。用于檢測血清中游離不完全抗體。沉淀反應（precipitationreaction）：是指可溶性抗原和相應抗體在適當條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)可見沉淀現(xiàn)象。免疫濁度測定：是應用抗原抗體結(jié)合在液體中形成免疫復合物干擾光線可用儀器檢測特點，將現(xiàn)代光學測量儀器和自動分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應用于沉淀反應，對各種液體介質(zhì)中微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進行定量測定技術。鉤狀效應（highdosehookeffect）：免疫濁度測定，抗原過量導致形成免疫復合物（IC）分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少。單向免疫擴散實驗：是先將一定量抗體混于瓊脂凝膠中，使待測抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見沉淀環(huán)。環(huán)直徑或面積大小和抗原含量正相關。常用于IgG/A/M、補體C3/C4等血漿蛋白測定。雙向免疫擴散試驗：是將抗原核抗體加在同一瓊脂板對應孔中，各自向?qū)Ψ綌U散，在濃度比例恰當處形成沉淀線。①沉淀線靠近抗原孔，說明抗體濃度較大；靠近抗體孔則說明抗原濃度大。②形成沉淀線彎向分子量大一方。③（待測物為兩種抗原）兩條沉淀線互相吻合相連，兩抗原中存在相同表位；兩條沉淀線交叉，說明兩抗原完全不同；兩條沉淀線相切，提示兩抗原之間有部分相同。對流免疫電泳（CIEP）：實質(zhì)上是雙擴和電泳結(jié)合。在pH8.6堿性緩沖液瓊脂中進行電泳，分子量小、等電點低、帶有較多負電荷Ag泳向陽極，而Ab球蛋白等電點偏高（約為6--7），在pH8.6時帶負電荷較少，加上分子量較大，泳動慢，受電滲（指電場中液體對固體支持物相對移動）干擾后向陰極倒退，這樣抗原抗體作相對運動，在較短時間內(nèi)即可相遇，在孔間兩者分子比例合適地方形成沉淀線。（抗原加在-級，抗體加在+級）抗原濃度越高，沉淀線越接近抗體孔，甚至超過抗體孔。本法簡便快速，靈敏度是雙擴8~16倍，可檢出蛋白質(zhì)濃度達μg/ml，常用于Ag/Ab性質(zhì)/效價/純度測定?；鸺庖唠娪荆≧IE）：實質(zhì)上是單擴和電泳結(jié)合。是將抗體混合于瓊脂中，電泳時，抗體不移動，抗原由負極向正極移動，并隨抗原濃度下降，抗原泳動基底區(qū)也逐漸變窄，抗原抗體免疫復合物形成沉淀西安也越來越窄，形成一個火箭狀不溶性復合物沉淀峰?？贵w濃度一定時，沉淀峰高度和抗原量呈正相關。其靈敏度可達ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。免疫電泳（IEP）：將待測標本（蛋白質(zhì)抗原）置于瓊脂凝膠中電泳，樣品中各蛋白成分因所帶電荷、分子量及構型不同，被分成肉眼不可見若干區(qū)帶。然后沿和電泳方向開一平行抗體槽并加入抗血清，置室溫或37度使兩者擴散。18-24h后，各區(qū)帶蛋白和相應Ab在相應位置上形成弧形沉淀線。Ag越多，沉淀線越靠近Ab槽，其沉淀線越粗，可做細微蛋白質(zhì)組分分析，僅為定性實驗。免疫固定電泳（IFE）：實質(zhì)是區(qū)帶電泳和沉淀反應相結(jié)合。先將血清蛋白質(zhì)置于瓊脂凝膠中進行區(qū)帶電泳分離，再將固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清加于凝膠表面泳道上，經(jīng)過孵育，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透、擴散，抗原抗體直接發(fā)生沉淀反應，洗脫游離抗體，形成抗原抗體復合物則保留在凝膠中。經(jīng)氨基黑，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)被著色，根據(jù)電泳移動距離分離單克隆組分，可對各類Ig及其輕鏈進行分型。最常用于M蛋白鑒定。放射性核素：具有放射性核素，在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化變?yōu)榱硪环N（放射性）核素，并同時釋放射線。這一轉(zhuǎn)變過程稱為放射性衰變。放射化學純度：指在標記物中結(jié)合在抗原（或抗體）上放射活性占該標記物總放射活性百分比。比放射活性：是指單位質(zhì)量標記物中所含放射性活度，或每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目。放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素標記抗原和非標記抗原（待測/標準抗原）同時和限量特異性抗體進行競爭性結(jié)合反應，通過測定放射性核素標記抗原和抗體復合物放射性活度，經(jīng)相應數(shù)學函數(shù)關系推算待測抗原含量。免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性標記抗體來測定樣品中抗原方法，所用標記抗體是過量，抗原全部是非標記。待測抗原和過量標記抗體結(jié)合反應形成標記抗體-抗原復合物及游離標記抗體，測定是標記抗體-抗原復合物量.熒光免疫技術：是將抗原抗體反應和熒光技術相結(jié)合而建立一種免疫熒光技術，具有高度特異性、敏感性和直觀性。熒光抗體技術（FAT）：以熒光素標記抗體對抗原進行定位染色，并借助熒光顯微鏡觀察標本片上熒光染色形態(tài)，從而判斷是否存在待測抗原，這種技術就是~。熒光抗體染色方法：直接法（簡便快速特異性強，但敏感性不如間接法，一種熒光抗體只能檢測一種抗原）、間接法（敏感性比直接法高5~10倍，一種熒光二抗可檢測多種抗原/抗體，但容易產(chǎn)生非特異性熒光）、雙標記法（用于檢測同一標本中兩種抗原）熒光：熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能量后，使原來處于基態(tài)電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)電子以發(fā)射光形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為~。①發(fā)射光譜：是指固定激發(fā)光波長，在不同波長下所記錄到樣品發(fā)射熒光譜圖②激發(fā)光譜：是指固定檢測發(fā)射光（熒光）波長，用不同波長激發(fā)光照射樣品得到熒光譜圖。③熒光效率：是指熒光分子將吸收光能轉(zhuǎn)變成熒光百分率，和發(fā)射熒光光量子數(shù)值成正比。④熒光效率＝發(fā)射熒光光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光光量子數(shù)（激發(fā)光強度）⑤熒光猝滅：熒光分子輻射能力在受到激發(fā)光較長時間照射后會減弱現(xiàn)象。只有那些能產(chǎn)生明顯熒光有機化合物才能作為熒光色素。stokes位移：即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜波長差。鑭系元素stokes位移大（273nm），激發(fā)/發(fā)射光譜不重疊，可減少干擾。酶免疫技術：是將酶高效催化反應專一性和抗原抗體反應特異性相結(jié)合一種免疫標記檢測技術。是將酶和抗原或抗體結(jié)合成酶標記結(jié)合物（酶標抗原/抗體），酶標結(jié)合物既保留了抗原/抗體免疫學活性，同時也保留了酶對底物催化活性。在酶標記抗體（抗原）和抗原（抗體）特異性反應完成后，加入酶作用相應底物，通過酶催化底物產(chǎn)生顯色反應，對抗原或抗體進行定位、定性或定量測定。常用酶：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用底物：HRP有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。ALP為對-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。β-Gal為4-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）常用標記方法：交聯(lián)法（戊二醛~）和直接法（改良過碘酸鈉法）固相載體選擇：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜載體包被（coating）：將抗體或抗原結(jié)合在固相載體上過程。封閉（blocking）：用1%~5%牛血清蛋白或5%~20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合位點，消除非特異性吸附干擾。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）【基本原理】把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗體）；將抗原或抗體和酶連接成酶標記抗原或抗體（既保留免疫活性又保留酶活性）；在測定時，把受檢標本（測定其中抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同步驟和固相載體表面抗原或抗體起反應，用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復合物和其它物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上酶量和標本中受檢物質(zhì)量有一定比例，加入酶反應底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物量和標本中受檢物質(zhì)量直接相關，根據(jù)顏色反應深淺進行定性或定量分析。（一）ELISA檢測抗原方法主要有：1、雙抗體夾心法：適用于至少兩個抗原決定簇（AD）Ag。先將特異性抗體和固相載體結(jié)合，形成固相抗體，加入待測標本并溫育，使標本中抗原和固相抗體充分反應，形成固相抗體抗原復合物，洗滌去除其他游離成分；然后加入酶標記抗體并溫育，使固相抗體抗原復合物和酶標記抗體結(jié)合，形成固相抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，為“雙抗體夾心”；洗滌去除游離酶標記抗體。加入底物，固相載體結(jié)合酶可催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物顯色程度進行抗原定性或定量檢測。臨床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人絨毛膜促性腺激素HCG等項目檢測。2、雙位點一步法：該法是針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠抗原決定簇，分別制備兩種單克隆抗體，在包被時使用一種單抗，酶標記時使用另一種單抗。測定時將含待測抗原標本和酶標記抗體同時加入反應體系，兩種抗體分別和不同抗原決定簇結(jié)合，只進行一次溫育，在洗滌后即可加底物進行顯色反應。擔當待測抗原濃度過高時，可出現(xiàn)鉤狀效應，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將標本適當稀釋后重新測定。）3、競爭法：適用于小分子Ag或半抗原（只有一個AD）。先用特異性抗體包被固相載體，然后同時加入待測抗原和酶標記抗原，待測樣本中抗原和酶標記抗原競爭性和固相載體上特異性抗體結(jié)合，溫育一段時間后洗滌，加入底物顯色。（二）ELISA檢測抗體方法主要有：1、間接法：檢測Ab最常用方法。常用酶標記羊抗人IgG。2、雙抗原夾心法：靈敏度和特異性高于間接法，原理類似雙抗體夾心法，操作步驟也基本相同，也可采用一步法，但一般不會出現(xiàn)鉤狀效應。臨床上乙型肝炎表面抗體HBsAb測定常用此法。3、競爭法：當相應抗原材料中含有難以去除雜質(zhì)，不易得到足夠純化抗原或抗原性質(zhì)不穩(wěn)定時，可采用此方法。主要用于測定HBcAb和HBeAb。原理見下：（1）HBcAb競爭法：先將核心抗原包被在固相載體上形成固相抗原，，然后加入待測標本和酶標記特異性核心抗體，此時待測標本中HBcAb和酶標記HBcAb競爭性地和固相載體上核心抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強弱和待測標本中HBcAb含量負相關。（2）HBeAb競爭法：先將HBeAb包被在固相載體上形成固相抗體，同時加入待測標本和中和抗原HBeAg，此時待測標本中HBeAb和固相抗體競爭性地結(jié)合中和抗原HBeAg，溫育后洗滌，加入酶標記HBeAb，酶標記抗體和結(jié)合于固相抗體上特異性抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入底物顯色，顯色強弱和待測標本中HBeAb含量呈負相關。4、捕獲法：又稱反向間接法，主要用于血清中特定Ig類別測定，最常用于病原體急性感染診斷中IgM型抗體檢測。原理：首先將針對IgM第二抗體包被于固相載體形成固相抗體，加入待測標本后，標本中所有IgM（特異/非特異）即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其和固相載體上捕獲IgM特異性抗體結(jié)合，再加入針對特異性抗原酶標記抗體，形成固相抗人μ鏈IgM-抗原-酶標記抗體復合物，最后加入底物顯色，即可對待測標本中抗原特異性IgM進行定性或定量測定。此法臨床上常用于病原體急性感染實驗室診斷，如急性甲肝時可檢測HAV-IgM抗體，急性乙型肝炎時可檢測抗HBc-IgM抗體。發(fā)光免疫分析（CLIA）：是將發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合而建立起來一種檢測微量抗原或抗體新型標記免疫分析技術。兼有高靈敏性和高特異性。發(fā)光：分子/原子中電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并施放光子過程。化學發(fā)光：伴隨化學反應過程所產(chǎn)生光發(fā)射現(xiàn)象。發(fā)光效率：又稱化學發(fā)光反應量子產(chǎn)率，是指發(fā)光劑在反應中發(fā)光分子數(shù)和參加反應分子數(shù)之比，取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子化學激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射效率?；瘜W發(fā)光免疫技術可分為均相反應（不需分離）和非均相反應（需要分離）非均相分離方式有：固相分離、過濾分離、珠式分離、順磁性顆粒分離?！净瘜W發(fā)光劑】直接化學發(fā)光劑：魯米諾和吖啶酯（常用）間接化學發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物【標記技術】常用標記方法：碳二亞胺縮合法、過碘酸鈉氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法影響標記因素：發(fā)光劑選擇、被標記蛋白質(zhì)性質(zhì)、標記方法選擇、原料比、標記率、溫度、純化和保存?；瘜W發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）【原理】：是用參和催化某一化學發(fā)光反應酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來標記抗體（或抗原），和待測標本中相應抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物濃度。【特點】：①屬酶免疫測定范疇，測定過程和ELISA類似，僅最后一步酶反應底物改為發(fā)光劑、測定儀器改為光信號檢測儀；②酶標記抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定；③酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出光穩(wěn)定，持續(xù)時間長，便于記錄和測定。電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）【原理】是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應（它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程）。在反應體系內(nèi)待測標本和相應抗體發(fā)生免疫反應，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復合物，復合物進入流動室，同時注入TPA緩沖液。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在點擊下面電磁鐵吸引住，而未結(jié)合標記抗體和標本緩沖液被沖走。和此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學發(fā)光。光信號由安裝在流動室上方光信號檢測器檢測，光強度和待測抗原濃度成正比?！咎攸c】：①三聯(lián)吡啶釕在電場中因不斷得到三丙胺提供電子，可周而復始發(fā)光，持續(xù)時間長，信號強度高，容易測定、控制；②三聯(lián)吡啶釕直接標記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標記物理化特性；③試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好。生物素（B）又稱維生素H，分子式為C10H16O3N2S，等電點（pI）為3.5。生物素結(jié)構中，I環(huán)為咪唑酮環(huán)，，是和親合素結(jié)合主要部位；II環(huán)為噻吩環(huán)，含有一個戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標記抗體或其他分子唯一結(jié)構。抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原活性不受影響。多種酶經(jīng)生物素化后，其催化能力保持不變或稍有降低。生物素-親合素系統(tǒng)【特點】：高特異性、高敏感性、穩(wěn)定強、實用性強【應用】：在標記免疫技術中可應用于標記信號放大環(huán)節(jié)，也可用于固相包被（或分離）環(huán)節(jié)一、應用于固相載體包被環(huán)節(jié)鏈霉親合素（親合素）為弱酸性蛋白，可以吸附在固相載體（聚苯乙烯微孔板或納米微球）表面，形成鏈霉親合素包被固相載體；利用生物素標記抗原（或抗體），使待包被抗原（抗體）通過生物素和固相材料表面鏈霉親合素結(jié)合，實現(xiàn)間接包被。此種包被模式不但可增加抗原（或抗體）包被數(shù)量，也可減少空間位阻效應，提高抗原（或抗體）利用效率。此外，若固相材料不和生物素化抗原（或抗體）結(jié)合，待生物素化抗原（或抗體）和待檢抗體（或抗原）反應后，再加入鏈霉親合素預包被磁性納米微球，含有生物素免疫復合物可結(jié)合在固相載體表面，達到同樣分離效果。二、應用于檢測系統(tǒng)信號放大生物素-親合素系統(tǒng)用于檢測信號放大，可提高標記免疫分析敏感性。基本方式有生物素-親合素-生物素模式（BAB）和生物素-親合素模式（BA）或標記親合素模式。如將生物素標記在第一抗體上稱為直接法，如生物素標記在第二抗體上稱為間接法。①生物素-親合素-生物素模式特點是生物素標記分子（如生物素標記抗體/酶蛋白），以游離親合素為橋，連接抗原-抗體和信號檢測系統(tǒng)；由于一個親合素分子能同時結(jié)合4個生物素，且一個生物素大分子可標記多個生物素而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應，提升檢測敏感性。②實際應用中ABC法：預先按一定比例將親合素和生物素標記示蹤物質(zhì)（如生物素標記ALP）混合，形成可溶性親合素-生物素化酶標復合物，同時確保預留一定位點和生物素化抗體（或抗原）結(jié)合。此種方法能減少操作步驟，又能實現(xiàn)標準化操作（有商品化試劑）。將ABC法應用于雙抗體夾心ELISA中，形成ABC-ELISA，為常用方法。固相膜免疫分析技術：是以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過微孔膜也可以通過毛細管作用在膜上向前移行特性，以酶標記或各種有色微粒子（如彩色膠乳、膠體金或膠體硒等）標記抗體或抗原作為標記物，通過抗原抗體反應進行抗原或抗體檢測快速檢驗方法。膠體金免疫技術：是以膠體金作為示蹤標記物或顯色劑，應用于抗原抗體反應一種標記免疫測定技術。膠體金：也稱金溶膠，是金鹽被還原為金原子后形成金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外雙離子層構成（內(nèi)層為負離子層AuCl2-，外層是帶正電荷H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定膠體狀態(tài)，形成帶負電疏水膠溶液，故稱膠體金。免疫金：是指膠體金和抗原或抗體等大分子物質(zhì)結(jié)合物。其制備過程實質(zhì)上是抗體蛋白等大分子被吸附到膠體金顆粒表面包被過程。（一）斑點金免疫滲濾試驗（DIGFA）【原理】是在以硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體滲濾裝置中，依次滴加標本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上，故溶液流經(jīng)滲濾裝置時和膜上抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達到快速檢測目（一般5min左右完成）陽性反應在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。本法簡化了操作步驟，達到簡便目，已成為“床旁檢測（POCT）”主要方法之一?！痉椒愋汀浚孩匐p抗體夾心法：將抗體包被在硝酸纖維素膜中央，滴加待檢標本，若標本中有待測抗原則在滲濾過程中和膜上抗體結(jié)合，然后滴加膠體金標記抗體，加洗滌液洗滌后，陽性者即在膜中央呈紅色斑點（膠體金聚集）。②間接法：將抗原包被在硝酸纖維素膜上，依次滴加待測標本、洗滌液和膠體金標記抗人IgG抗體，再加洗滌液洗滌，陽性者即在膜中央呈紅色斑點（膠體金聚集）。本法因受非目IgG干擾，易產(chǎn)生假陽性，臨床上較少使用。（二）斑點金免疫層析試驗（DICA）【原理】是將膠體金標記和蛋白質(zhì)層析技術相結(jié)合，以硝酸纖維素膜為載體快速固相膜免疫分析技術。在DICA中，滴加在膜一端標本溶液受載體末毛細管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物和固定于載體膜上某一區(qū)域抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金呈色條帶來判讀實驗結(jié)果。【方法類型】：雙抗體夾心法、競爭法、間接法（三）臨床應用及評價1、特點：操作簡便、快捷以及操作人員不需技術培訓，無需特殊儀器設備，試劑穩(wěn)定、便于保存等特點。2、靈敏度問題：靈敏度不及酶標法和酶發(fā)光免疫測定法，臨床應用中應引起高度重視。3、臨床應用：臨床只能作為定性/半定量試驗，目前主要應用于正常體液中不存在物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高物質(zhì)（如人絨毛膜促性腺激素HCG）。斑點酶免疫吸附試驗（Dot-ELISA）【原理】和常規(guī)ELISA相同，不同之處在于斑點-ELISA所用載體為對蛋白質(zhì)具有極強吸附力（近100%）硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色沉淀物，使NC染色?！炯夹g要點】1、抗原包被膜：加少量（1~2μL）抗原于膜上。由于NC膜吸附力強，故需在包被后進行封閉。2、抗原抗體反應：滴加樣品血清，其中待檢抗體即和NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標二抗。3、顯色反應：滴加能形成不溶有色沉淀底物溶液（如HRP標記物，常用二氨基聯(lián)苯胺）；陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見染色斑點。【方法評價】斑點-ELISA優(yōu)點為：NC膜吸附蛋白力強，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高6~8倍；試劑用量較ELISA約節(jié)約10倍；操作簡單，實驗及結(jié)果判斷不需特殊設備條件；吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果NC膜可長期保存（-20℃可長達半），不影響其活性。免疫印跡試驗（IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（EITB），通常又稱Western-blot。【原理】是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析相結(jié)合技術，具有分析容量大、敏感性高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達和分布一種常用方法，如組織抗原定性定量檢測、多肽分子質(zhì)量測定及病毒抗體或抗原檢測等?！炯夹g要點】1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）：抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極涌動，分子量越小，涌動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有染色后才顯出電泳區(qū)帶）。2、電轉(zhuǎn)移：將在凝膠中已經(jīng)分離條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1~2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離效果肉眼仍不可見。3、酶免疫定位：將印有蛋白質(zhì)條帶硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原固相載體）依次和特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物酶反應底物，使區(qū)帶染色。常用HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應條帶清晰可辨。并可根據(jù)SDS時加入分子量標準，確定各組分分子量?！痉椒▽W評價】1、抗體性質(zhì)：影響本試驗成敗一個主要因素是抗原分子中可被抗體時別表位性質(zhì)。只有那些能識別耐變形表位抗體可和抗原結(jié)合，所以在該試驗中常選用多克隆抗體。2、IBT靈敏度：一種是在電泳之前應用免疫沉淀法將抗原進行純化和濃縮。其他方法都是針對增強信號本身設計，包括使用信號更好和更強熒光實際或使條帶局部酶活性增強等。3、IBT法在臨床應用中存在一定局限性。非標記抗體酶免疫組織化學染色首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強抗酶抗體，通過免疫學反應將抗酶抗體和組織抗原聯(lián)系在一起。該方法避免了酶標記時對抗體損傷，同時也提高了方法敏感性【技術類型】（一）酶橋法抗酶抗體作為第三抗體，通過橋抗體（第二抗體）將特異性識別組織抗原第一抗體連接，形成酶