免疫學(xué)實驗技術(shù)

實驗須知

一.實驗課的目的要求

免疫學(xué)實驗課的目的是加強和鞏固對課堂講授的基本理論的理解和體

會，學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實驗的基本操作技術(shù)。為今后的實際工作和科研工

作打下基礎(chǔ)。為上好免疫學(xué)實驗課，要求同學(xué)做到如下各點：

1.課前務(wù)必做好充分預(yù)習(xí)，明確實驗?zāi)康?、原理、方法及操作中?/p>

注意事項，做到心中有數(shù)。

2.在實驗進程中，嚴格按照實驗指導(dǎo)所列步驟和要求進行操作，堅

持實驗的嚴肅性、嚴格性、嚴密性。

3.真實記錄實驗結(jié)果，對錯誤的結(jié)果要認真分析，找出原因，得出

結(jié)論。實驗完成后，寫出實驗報告及時交給老師批改。

4.嚴格遵守實驗室規(guī)則，防止各種事故發(fā)生。

二.實驗室規(guī)則

免疫學(xué)實驗材料，有些是病原微生物，在實驗中稍一不慎和防護卜一的

不善，便有發(fā)生人身感染的可能。所以要求同學(xué)認真遵守下列各點：

1.進入實驗室先把個人書包放到指定地點，穿好白大衣，實驗臺上

只放實驗指導(dǎo)、記錄本和文具。

2.實驗室內(nèi)必須肅靜、整潔，不得高聲談笑和隨便走動。

3.禁止吸煙、飲食，不能用手撫摩頭面，以防感染。

4.實驗中如發(fā)生割破皮膚及實驗材料破損事故，應(yīng)立即報告教師，

進行緊急處理。皮膚破傷可用2%紅汞或2%碘酒消毒。污染桌面、地面和

物品可用3%來蘇兒來消毒。

5.用過的有菌器材和培養(yǎng)物放于指定地點，經(jīng)過菌液的吸管放在裝

有消毒液的桶內(nèi)，用過的載片，用后立即放到消毒缸內(nèi)，不得棄置桌上。

6.注意節(jié)約實驗藥品，愛護實驗器材，如有損失和破損，立即報告

教師，等候處理。

7.易燃物品（酒精、二甲苯等）不準接近火源，如遇火險，先關(guān)掉

8.實驗結(jié)束。將實驗臺收拾整齊，擦凈桌面，然后脫下白大衣反疊

好放入衣柜內(nèi)，再洗手消毒后離去。

9.值日生掃好室內(nèi)衛(wèi)生，并檢查水電、煤氣等開關(guān)是否關(guān)好，防止

發(fā)生安全事故。

必選實驗

實驗一與免疫相關(guān)的細胞形態(tài)的觀察

目的要求:

觀察與免疫相關(guān)的幾種細胞的形態(tài)，了解它們在機體免疫反應(yīng)中的作

用。

實驗器材：

顯微鏡

血液涂片(瑞氏染色)

結(jié)締組織切片

方法：

油鏡觀察

一.血涂片的觀察

(A)紅細胞：淡紅色，無核的圓形細胞，因紅血球為雙網(wǎng)形，故邊

緣部分染色較深，中心較淺，直徑7—8微米。

(B)顆粒白血球

嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉狀，

可分1一5葉，核葉之間聯(lián)以染色質(zhì)細絲，染色質(zhì)染成粉色，其中充滿細小

的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。直徑10—12微米。

嗜酸性顆粒白血球：略大于嗜中白血球，細胞核染成紫色，通常為2

葉，胞質(zhì)充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。直徑10—15微米。

嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細胞質(zhì)中有大小不等

被染成紫色顆粒，顆粒數(shù)目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為1一2葉染成淡

蘭色。直徑10—11微米。

(C)無顆粒白血球

淋巴細胞：涂片中可觀察到中、小型兩種。小淋巴細胞與紅血球大小

相似，圓形。其中含致密的核，染成深紫色。周圍僅有一薄層嗜磴性染成

淡藍的細胞質(zhì)。中淋巴細胞較大，有較寬層的細胞，核圓形。6-8微米。

單核細胞：體積最大，細胞圓形。胞質(zhì)染成灰藍色。核呈腎形或馬蹄

形，染色略淺于淋巴細胞的核。直徑14-20微米。

二.肥大細胞的觀察（示教）

胞體較大，呈卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大均等的嗜磴性顆粒。其中含肝

素、組織胺等物質(zhì)。常成群地分布于血管的周圍。

三.漿細胞的觀察（示教）

細胞呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)豐富，呈嗜磴性。核圓形，著色深，多偏

于細胞的一側(cè)，染色質(zhì)核膜呈車輪分布。正常組織漿細胞少，慢性炎癥時

增多。漿細胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。

四.巨噬細胞：又稱組織細胞，細胞形態(tài)不規(guī)則。常伸出短而鈍突起,

有很強的吞噬能力。

附：

瑞特氏染色：

1.染色液配置

稱取瑞特氏染料01克溶于60ml甲醇中，過濾。貯褐色瓶中備用。（配

置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內(nèi)邊研邊滴加甲醉，使染料溶液得更好。）

2.瑞特氏染色法：

取小鼠骨動脈血，涂制玻片。干后用玻璃筆在涂處之兩側(cè)劃線（限制

染液流掉）。于劃線內(nèi)部滴加染液3-4滴，經(jīng)3-5分鐘后，再滴加等量的蒸

鐳水，輕輕晃動混合。經(jīng)5分鐘后，用蒸儲水洗凈，待干后用油鏡檢查。

實驗二沉淀反應(yīng)

可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合,在電解質(zhì)存在的條件下，兩者比例適

合，即可有沉淀物出現(xiàn)，叫沉淀反應(yīng)（Precipitation）.由于沉淀反應(yīng)抗原多

系膠體溶液。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。

為了求得抗原與抗體的適宜比例，保證有足夠的抗體，而且抗原分子

小，具有較大的反應(yīng)面積，因此操作匕1常是稀釋抗原，不稀釋抗體。

沉淀反應(yīng)的種類有環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免疫

電泳等。此外還有放射性同位素標記、酶標記等測定法。

(-)環(huán)狀沉淀反應(yīng)

當抗原與相應(yīng)抗體形成一個接觸面時，如二者比例適當，接觸面上可

形成一個乳白色的環(huán)狀物即為陽性沉淀反應(yīng)。

材料：

1.免疫血清：免疫兔抗人血清

2.抗原：人血清

3.小沉淀管、毛細吸管、橡皮頭、生理鹽水。

方法：

1.取小沉淀管2只，以毛細吸管吸取抗人血清約0.2毫升，加入第

一管，加時注意不能有氣泡。

2.以毛細吸管吸取生理鹽水0.2毫升加入第二管。

3.用毛細吸管吸入血稀釋0.2毫升加入各管，加時應(yīng)注意使抗原溶

液緩緩由管壁流下，輕浮于血清面上，使成一明顯界面，切勿使之相混。

4.置室溫中10-20分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環(huán)，若有則為陽

性。

(二).瓊脂擴散試驗

瓊脂擴散是抗原抗體在凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應(yīng)。

抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中相遇時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線。

這種沉淀線是一組抗原抗體的特異性復(fù)合物。如果凝膠中有多種不同抗原

抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當部位形成獨立的沉淀線，

因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴散試驗可根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的方

式和特性分為單向免疫擴散、雙向免疫擴散、免疫電泳、對流免疫電泳、

單向及雙向火箭電泳試驗。

（1）單向瓊脂擴散試驗

材料：

1.診斷血清（抗體：抗人IgG或IgA免疫血清）

2.待檢血清（抗原）：人血清

3.參考血清：全國統(tǒng)一人血清免疫球蛋白參考血清（批號不同，免疫

球蛋白含量不同）。

4.其它：生理鹽水、瓊脂粉、微量進樣器、打孔器、玻璃板、濕盒等。

方法：

1.將適當稀釋（事先滴定）的診斷血清與予溶化的2%瓊脂在60℃水

浴預(yù)熱數(shù)分鐘后等量混合均勻制成免疫瓊脂板。

2.在免疫瓊脂板上按一定距離（1.2—1.5厘米）打孔，見圖1。

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圖1單向瓊脂擴散試驗抗原孔位置示意圖

1-5孔加參考血清，6-7孔加待檢血清

3.向孔內(nèi)滴加1：2,1：4,1：8,1：16,1：32稀釋的參考血清及

1：10稀釋的待檢血清，每孔10微升，此時加入的抗原液面應(yīng)與瓊脂板?

平，不得外溢。

4.已經(jīng)加樣的免疫瓊脂板置濕盒中37℃溫箱擴散24小時。

5.測定各孔形成的沉淀環(huán)直徑（mm）,用參考血清各稀釋度測定值繪出

標準曲線，再由標準曲線查出被檢血清中免疫球蛋白的含量。

（2）雙向瓊脂擴散試驗

材料：

1.診斷血清：兔抗人血清

2.待測血清：人血清

3.陰性對照血清

4.其它：生理鹽水、瓊脂粉、載玻片、打孔滯、微量進樣器等。

方法：

1.取一清潔載玻片，傾注3.5—4.0亳升加熱熔化的1%食鹽瓊脂制成

瓊脂板。

2.凝固后，用直徑3毫米打孔器，孔間距為5毫米?？椎呐帕蟹绞饺?/p>

圖2所示。

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。。。

圖2雙向瓊脂擴散原抗體孔位置示意圖

3.用微量進樣器于中央孔加抗體，于周圍孔加各種抗原。加樣時勿使

樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結(jié)果。

4.加樣后的瓊脂板收入濕盒內(nèi)置37℃溫箱中擴散24-48小時。

5.結(jié)果觀察：若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原一抗體復(fù)合

物，在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。若在72小時

仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。實驗時至少要做一陽性對照。出現(xiàn)陽性對

照與被檢樣品的沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真正陽性。

6.結(jié)果分析：瓊脂擴散結(jié)果受許多因素影響。

①抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系：在相鄰兩完全相同的抗原與抗體

反應(yīng)時，則可出現(xiàn)兩單沉淀線的融合。反之，如相鄰抗原完全不同時，則

出現(xiàn)沉淀線之交叉：兩種抗原部分相同時，則出現(xiàn)沉淀線的部分融合。見

圖3。

圖3雙擴散試驗結(jié)果示意圖

A：已知抗體a、b：陽性對照

c、d、e、f：被檢材料

②抗原濃度與沉淀先導(dǎo)形狀的關(guān)系：兩相鄰抗原濃度相同，形成對稱

相融合的沉淀線；如果兩抗原濃度不同，則沉淀線不對稱，移向低濃度的

一邊。見圖4。

圖4抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系

a、b：抗體A、A\B：抗原

A、B完全不同A、A，部分相同

③溫度對沉淀線的影響：在一定范圍內(nèi)，溫度擴散快。通常反應(yīng)在0-37

℃卜進行。在雙向擴散時，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度，可在37

℃下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱(4℃)中為佳。

④瓊脂濃度對沉淀線形成速度的影響：一般來說，瓊脂濃度越大，沉

淀線出現(xiàn)越慢。

⑤參加擴散的抗原與抗體間的距離對沉淀線形成的影響：抗原、抗體

相距越遠，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時，孔間距離以

0.25-0.5cm為好，距離遠影響反應(yīng)速度。當然孔距過遠，沉淀線的密度過

大，容易發(fā)生融合，有礙對沉淀線數(shù)目的確定。

⑥時間對沉淀線的影響：沉淀線形成一般在1-3天出現(xiàn)，14-21天出現(xiàn)

的數(shù)目最多。玻片法可在1-2小時出現(xiàn)，一般觀察72小時，放量過久可出

現(xiàn)沉淀線重合消失。

（三）對流免疫電泳試驗

對流免疫電泳是在瓊脂擴散基礎(chǔ)上結(jié)合電泳技術(shù)而建立的一種簡便而

快速的方法。此方法能在短時間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果，故可用于快速診斷，敏感性

比雙向擴散技術(shù)高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6條件下帶負電荷，所以在電場作用下都向E極移動。

但由于抗體分子在這樣的PH條件下只帶微弱的負電荷，而且它的分子量

又較大（為r球蛋白）。所以游動慢。更重要的是抗體分子受電滲作用影響

較大，也就是說點滲作用大于它本身的遷移率。所謂電滲作用是指在電場

中溶液對于一個固定固體的相對移動。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性緩沖

液中進行電泳，它帶有負電荷，而與瓊脂相接觸的水溶液就帶正電荷，這

樣的液體便向負極移動?？贵w分子就是隨著帶正電荷的液體向負極移動的。

而般的蛋白質(zhì)（如血清抗原）也受電滲作用的影響，使泳動速度減慢，

但它的電泳遷移率遠遠大于電滲作用?這樣抗原體就達到了定向?qū)α?，?/p>

兩者相遇且比例合適時便形成肉眼可見的沉淀線。

材料：

1.診斷血清：免抗人免疫血清

2.待檢血清：人血清

3.陰性對照血清

4.PH8.6,離子強度0.05M的巴比妥緩沖液配置

巴比妥鈉10.3克

巴比妥1.84克

蒸儲水1000毫升

5.緩沖瓊脂板：將純化的瓊脂用PH8.6離子強度0.025的巴比妥緩沖

液（用0.05M的巴比妥緩沖液稀釋一倍即可）配成1.5%的瓊脂，加入

0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱內(nèi)備用。

6.電泳儀

7.其他：生理鹽水、打孔器、微量進樣器。

方法：

1-瓊脂板的制備根據(jù)需要可選用大玻板（6厘米X9厘米）和（小玻

片）兩種。大玻板約需瓊脂10毫升，小玻片約需3.5毫升，凝固后按圖打

孔，方法同瓊脂擴散試驗。

2.加樣：左側(cè)孔內(nèi)加患者血清（原血清及10倍稀釋血清各占一孔）,

右側(cè)內(nèi)加抗血清，每片應(yīng)有陽性對照。

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OO00

抗抗

原體

圖5對流免疫電泳抗原孔、抗體孔位置示意圖

3.電泳

用國產(chǎn)普通電泳儀。其內(nèi)加0.05mPH8.6的巴比妥緩沖液，加至電泳槽

高度的三分之二處，注意兩槽內(nèi)液面盡量水平。將加好樣品的玻板置于電

泳槽上，抗原端接負極，抗體端接正極，用2—4層濾紙浸濕作鹽橋，濾紙

與瓊脂板聯(lián)接處為0.5厘米。以板寬度計算電流，以板的長度計算電壓。

要求電流量為2—3毫安/厘米，即大板為20毫安，小板為10毫安。電壓

為4-6伏/厘米。通電45分鐘一2小時后觀察結(jié)果。

4.結(jié)果觀察：在黑色背景上方，用散射光多個角度觀察，在對孔之間

有白色沉淀線即為陽性對照應(yīng)出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。如果抗原，兩極微

沉淀條紋不清晰，于37℃保溫數(shù)小時可增強沉淀條紋的清晰度。

5.影響結(jié)果的因素

（1）抗原抗體的比例：抗原抗體比例適應(yīng)時容易出現(xiàn)沉淀帶，反之

不易發(fā)生。當抗體濃度恒定時，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時，作10倍、

20倍或更高倍數(shù)稀釋可以提高陽性率。隨稀釋度的增加，抗原抗體的比例

發(fā)生變化，沉淀線由靠近抗血清孔向逐步移向兩孔中間，并可出現(xiàn)不典型

的沉淀線如弧形、八字須形、斜線形，這些也是陽性，應(yīng)予注意。

（2）兒組電泳緩沖液其電泳結(jié)果以巴比妥鈉一鹽酸緩沖液靈敏度

最高。巴比妥一巴比妥鈉次之。Tris緩沖液更差。

（3）電壓與電流時電泳時間需要長些：電壓電流增大時，電泳時間

可更短。但電壓過高則孔徑變形，電流過大抗原抗體蛋白易變性，干擾實

驗結(jié)果。一般選擇每厘米5毫升，電泳時間改為1.5小時。

（四）免疫電泳實驗

免疫電泳實驗是先將抗原物質(zhì)在瓊脂凝膠中做電泳分離，然后于凝膠

槽中加入抗體血清。使抗原抗體進行雙向擴散，在比例適宜部位形成特異

的抗原抗體沉淀弧線。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復(fù)合物，故可用抗

原成分分析：且可以根據(jù)其遷移率與抗體所出現(xiàn)的特異反應(yīng)進行鑒定。

材料：

1.待檢標本（抗原）：正常人血清。

2.抗體：正常人血清的家兔免疫血清。

3.1.5%離子瓊脂（系用巴比妥緩沖液配制的）

4.電泳儀

5.巴比妥緩沖液：

巴比妥1.84克

巴比妥鈉10.3克

蒸儲水1000毫升

pH8.6,離子強度（M）0.05

6.其它：載物玻片，直徑3毫米打孔器，20mmx2mm玻璃鑄型，微

量進樣器。

方法：

1.取載物玻片（7.5x2.5厘米）加上3.5毫升1.5%瓊脂凝膠，制成2

毫米厚的瓊脂板。

2.按圖位置，在瓊脂板未凝固時，放入抗血清槽鑄型，注意勿使鑄型

全部浸入瓊脂中，待凝固時再打孔。

3.加待檢標本：用微量進樣器往孔中加1一5微升。

4.電泳：電壓9—7伏/厘米，泳動15—20小時。

5.電泳后取出抗血清槽鑄型，加入抗血清，進行雙擴散，一般在24

小時內(nèi)沉淀弧出全。

6.觀察結(jié)果：或描繪、拍照或進行染色，染色后的標本便于結(jié)果分析

及保存。

O------------Ag

IT-Ab

O隨

圖6免疫電泳抗原孔和抗體槽位置示意圖

（五）火箭電泳試驗

火箭電泳實際是一種定量免疫電泳。其原理為：在電場作用下，抗原

在含定量抗體的瓊脂介質(zhì)中泳動，二者比例在合適時在較短時間內(nèi)形成狀

似火箭或錐形的沉淀線，而此沉淀線的高度常與抗原量成正比關(guān)系，因此

本法可以測定樣品中抗原的含量。

材料：

1.診斷血清（抗體）：抗人IgG或IgA免疫血清

2.待檢血清（抗原）：人血清

3.參考血清

4.pH8.6,離子強度0.05M巴比妥緩沖液配制（見對流免疫電泳試驗）

5.其它：瓊脂粉，微量進樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀

方法：

1.抗體瓊脂板的制備

同單向擴散法，但注意稀釋液應(yīng)用pH8.6離子強度0.05M的巴比妥緩

沖液。

2.打孔見下圖

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圖7火箭電泳抗原孔位置圖

3.將用緩沖液稀釋的適宜濃度的參考血清及適當稀釋的抗原（人血清）

分別加入各孔中，每孔10或20微升，要求加量準確而不外溢。

4.把加完樣的免疫瓊脂板放入電泳槽中進行電泳，電壓4—6伏/厘米,

電泳時間1—5小時.，直到大部分抗原孔前端出現(xiàn)頂端尖窄而完全閉合的火

箭狀沉淀線，關(guān)閉電源。

5.取下瓊脂板，以抗原孔中心為起點，量出各火箭狀沉淀線的高度。

同單向瓊脂擴散法繪制標準曲線，查出待檢血清中1g含量。

實驗三凝集反應(yīng)

當顆粒性抗原與其相應(yīng)抗血清混合時，在有一定濃度的電解質(zhì)環(huán)境中，

抗原凝集成大小不等的凝集塊，叫做凝集反應(yīng)。

凝集反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷和各種抗原性質(zhì)的分析。即可用已

知免疫血清來檢查未知抗原，亦可用己知抗原檢測特異性抗體。

一.直接凝集反應(yīng)

顆?？乖c抗體直接結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象叫直接凝集反應(yīng)。

（一）玻片凝集反應(yīng)

材料：

1.診斷血清：1：10稀釋的傷寒桿菌診斷血清

2.菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物

3.生理鹽水、載玻片、毛細吸管

方法：

1.取清潔玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。無菌操作下，用

接種環(huán)于1、2格內(nèi)加1：10稀釋傷寒桿菌診斷血清1-2滴，第三格加1-2

滴生理鹽水。

2.無菌操作下，用接種環(huán)取傷寒桿菌培養(yǎng)物少許，混于第三格中，再

混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因為這樣將使診斷血清混入

鹽水而影響對照結(jié)果），將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時取

菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。

3.同法取枯草桿菌培養(yǎng)物少許，于第二格內(nèi)混勻。

4.輕輕搖動玻片，經(jīng)1-2分鐘后肉眼觀察，出現(xiàn)乳白色凝集塊者，即

為陽性反應(yīng)；仍為平等的乳濁液者，即為陰性反應(yīng)。如結(jié)果不夠清晰，可

將玻片放于低倍顯微鏡卜觀察。

（二）試管凝集反應(yīng)

為一種定量試驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相

對含量。

材料：

1.診斷血清1：10稀釋傷寒桿菌“H”血清，1：10稀釋傷寒桿菌“O”

血清。

2.菌液：傷寒桿菌“H”菌液，傷寒桿菌“0”菌液。

3.生理鹽水，小試管，吸管。

方法：

1.取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆

注明號碼，于每管中分別加入0.5毫升生理鹽水。

2.在第1排1管中加入1：10稀釋傷寒H血清0.5毫升，于管內(nèi)連續(xù)

吹吸3次，使血清與鹽水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管，同樣

予以混勻后吸出0.5毫升注入第3管。依次類推，稀釋到第6管，自第6

管吸出0.5毫升棄去。此時，自第1管至第6管的血清稀釋倍數(shù)為1：20,

1：40,1：80,1：160,1：320,1：640?第7管不加血清作為對照。

3.同法用吸管吸取1：10稀釋傷寒桿菌O血清加入第2排第1管，

并依次如上法予以稀釋。

4.用移液管吸取傷寒桿菌H菌液,加收第1排各管中每管0.5毫升（由

鹽水對照管開始，依次由后向前加入）此時血清稀釋倍數(shù)又增加了倍。

5.同法于第2排各管中加入傷寒O菌液0.5毫升。

6.將各管振蕩混勻，放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過夜

次日取出觀察結(jié)果。

觀察結(jié)果：

1.觀察切勿搖動試管，以免凝集塊分散。

2.先看對照管，此管應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管內(nèi)液體仍成混濁狀態(tài)。但如放

置時間較長，細菌堆于管底成小圓點狀，為陰性反應(yīng)。

3.試驗管應(yīng)自第1管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀

邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用

“+”號表示如下：

“++++”凝集很強，管內(nèi)液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底：

“+++”凝集強，管內(nèi)液體不完全澄清稍有輕度混濁，凝集塊沉于管底;

“++”凝集中等強度，液體半澄清，凝集塊沉于管底；

“+”凝集弱，管內(nèi)液體混濁，少量凝集塊沉于管底；

“一”不凝集，管內(nèi)液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。

4.輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態(tài)，對照管的細菌在振蕩時呈煙霧

狀上升，隨即消散，細菌分散仍呈混濁狀態(tài)?！癏”菌液的凝集塊疏松呈棉

狀，大片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎?！?”菌液凝集呈緊密顆粒狀,

沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。

5.記錄觀察的結(jié)果并制定凝集效價。通常以能產(chǎn)生明顯凝集(++)

的血清大稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價。如血清的最低稀釋度(即第1

管1：40)仍無凝集應(yīng)報告為低于1：40。如血清的最高稀釋度(即第6

管1：1280)仍顯完全凝集現(xiàn)象。，應(yīng)報該血清效價高于1：1280。

二.間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒載體上，然后與相應(yīng)的

抗體結(jié)合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。間接凝

集反應(yīng)比直接凝集反應(yīng)敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。

(-)間接血球凝集試驗

間接血球凝集試驗是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細

菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏紅血

球”。這種致敏的紅血球具有細菌的抗原性，與相應(yīng)的抗血清相遇可產(chǎn)生凝

集現(xiàn)象。

間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質(zhì)浸

出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質(zhì)時則用來吸附的

紅血球需先用糅酸予以處理。

材料：

1.抗原一傷寒桿菌o抗原

2.免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等

方法：

L“O”抗原的制備：

將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時，離

心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4℃冰箱備用。

2.致敏紅血球懸液制備：

取一定稀釋度的抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液,混合后放37℃水浴

箱中，每隔15分鐘取出振搖?次，共經(jīng)2小時。然后取出，用生理鹽水洗

滌3次，而配制成0.5%懸液即成。

3.試驗步驟：

(1)小試管9只標好號碼于試管架上。

(2)第1管加入0.9毫升生理鹽水，其余各管各加入0.5毫升。

(3)以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清0.1毫升加入第I管，混勻后

吸取0.5毫升注入第2管，同樣第2管的血清與鹽水混勻后吸取0.5毫升注

入第3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄去。第9

管不加血清作對照。

(4)于每管加入0.5毫升已經(jīng)致敏的0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后

放入37℃水浴中2小時后觀察結(jié)果。凡最高血清稀釋度的免疫血清試管中

呈現(xiàn)完全血凝者，即為該血清的間接血清效價。

(-)間接凝集抑制試驗

若使可溶性抗原與相應(yīng)抗體先混合，充分作用后再加入有關(guān)的免疫微

球，因抗體一被可溶性抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫

間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝

集抑制試驗。

妊娠試驗：

孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當往尿中加入抗

絨毛膜促性腺激素抗體時，由于發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，抗體被消耗，

此時再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳

膠顆粒）。不發(fā)生反應(yīng)，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗陽性。反之，被

檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗,

當膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。出現(xiàn)均勻細小顆粒，妊

娠試驗為陰性。

材料：

1.抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原

2.抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清

3.被檢材料：孕婦尿

4.正常尿作對照用

5.黑反應(yīng)板1塊

6.滴管3只

方法：

1.用清潔滴管在反應(yīng)板上滴加一滴被檢尿。

2.再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。

3.滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強光線下，觀察結(jié)

果。出現(xiàn)均勻一致的細小顆粒為陰性反應(yīng)，懷孕。

注意事項：

1.試驗材料用具用前使溫度接近室溫（20℃左右）

2.被檢尿太混濁，需要小心過濾。

3.尿中有蛋白及血液時，不宜進行此試驗。

（三）協(xié)同凝集試驗

金黃色葡萄球菌細胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動物（豬、

兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體的Fc段結(jié)合。IgG的Fe段與SpA結(jié)

合后，兩個Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當其

與特異性抗原相遇時.，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。在以凝集反應(yīng)中，金黃色葡

萄球菌菌體成了IgG抗體的載體，稱為協(xié)同凝集反應(yīng).本反應(yīng)也可用于檢測

微量抗原.

A.材料：

1.抗原:可溶性傷寒桿菌0抗原

2.免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.10%CoWanl株金黃色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液

4.PBS0.5%甲醛PBS,吸管、滴管、玻片等

B.方法：

1.10%葡萄球菌菌懸液的制備：CoWanl株葡萄球菌接種于柯氏瓶，

37℃培養(yǎng)18-24小時，用PBS洗下菌苔，每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20分鐘。

沉淀菌用PBS洗兩次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室溫中固定3小

時。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酣。再用PBS洗滌2

次后配成10%菌懸液。

2.致敏葡萄球菌：

1毫升10%的菌懸液加01毫升傷寒O抗血清充分混合放入37c水浴

中30分鐘（中間需搖動兩次）。取出后經(jīng)每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20分鐘,

棄去上清液，沉淀菌用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。

3.協(xié)同凝集試驗

①取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上

混勻，觀察約2分鐘。一般在幾秒鐘內(nèi)即可發(fā)生凝集。

②滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒0菌培養(yǎng)物少

許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約2分鐘，記錄有無凝集。

③用傷寒“0”桿菌培養(yǎng)物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養(yǎng)

物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反應(yīng)，不出現(xiàn)凝集。

三.凝集吸收

腸道桿菌中的許多細菌都有部分相同的抗原結(jié)構(gòu)。因之一種細菌可與

另一種細菌相應(yīng)的抗血清發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。用一種過量的細菌抗原與發(fā)

生交叉凝集反應(yīng)的抗血清相結(jié)合。可將其共同抗體吸去，剩下抗體只能與

特異性抗原起反應(yīng)，這種試驗即稱凝集吸收試驗。

利用凝集吸收試驗可制備單價因子血清，以進行細菌抗原結(jié)構(gòu)的分析

及鑒定菌型。

材料：

1.免疫血清：1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清。

2.菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液。

3.試管、吸管、毛細吸管。

方法：

1.1/10稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進行玻片

凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說明二菌具有共同抗原結(jié)構(gòu),

故發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。

2.將一定量的腸炎桿菌菌液加入1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清中，

放37℃水浴箱中作用2小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，棄去沉淀。

3.將吸收過的上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀察結(jié)果。

如仍有凝集時則將此上清夜再加濃腸炎桿菌菌液進行吸收，方法如上。

4.重復(fù)吸收過的上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液進行玻

片凝集。如與前者無凝集而與后者有凝集，則表示傷寒桿菌免疫血清中的

抗腸炎抗體已被完全吸收。

實驗四溶血反應(yīng)和補體結(jié)合試驗

—.溶血反應(yīng)

免疫血清與其相應(yīng)的抗原細胞（血球、細菌及其組織細胞相遇，并在

補體的參與下可出現(xiàn)溶細胞反應(yīng)。依抗原、抗體的種類不同可有溶血反應(yīng)、

溶菌反應(yīng)等。

溶菌反應(yīng)只在某些細菌中出現(xiàn)（如霍亂弧菌）。應(yīng)用溶血反應(yīng)是補體結(jié)

合反應(yīng)中不可少的因素。溶血反應(yīng)是由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）

進行特異性的結(jié)合，并吸著了補體，而使紅血球在補體的作用下被溶解，

于是產(chǎn)生了溶血現(xiàn)象。

材料：

1.抗原：2%綿羊紅血球。

2.抗體：溶血素

3.補體：取健康豚鼠血清作為補體。

4.小試管、生理鹽水、水浴箱。

方法：

1.取小試管3只，按下表加入各物（容量單位為毫升）

試管2%紅血球溶血素（2單位）補體（2單位）生理鹽水結(jié)果

10.50.50.50.5

20.40.5—1.0

30.5—0.51.0

2.將上述3試管放在37c水浴箱內(nèi)15—30分鐘觀察有無凝血現(xiàn)象。

二.補體結(jié)合反應(yīng)

當抗原與其對應(yīng)的抗體結(jié)合時，所生成的抗原抗體復(fù)合物能從溶液中

將補體吸著此即謂補體結(jié)合。參與補體結(jié)合反應(yīng)的抗原是透明的溶液，故

補體結(jié)合現(xiàn)象不能被肉眼看出來，因此必須借助溶血系統(tǒng)（溶血素及相對

應(yīng)的羊血球）作為指示劑，來判定媒質(zhì)中有無游離的補體，近而推定媒質(zhì)

中未知抗原（或抗體）和己知抗體（或抗原）是否進行了特異性的結(jié)合。

本反應(yīng)具有很高的敏感性及特異性，因之常應(yīng)用于傳染病的診斷，特別診

斷病毒疾病和梅毒。

由于參與本反應(yīng)的各種成分間有著一定量的關(guān)系，因此在作本試驗之

前，必須通過一系列的預(yù)備實驗來確定各成分的使用量，故本反應(yīng)的實驗

方法較為復(fù)雜。

本次實驗以傷寒桿菌免疫血清與其相對應(yīng)的抗原補體結(jié)合試驗為例。

材料：

1.抗原：傷寒的抽出液

2.抗體：傷寒桿菌的免疫血清

3.補體：豚鼠血清

4.溶血素：抗綿羊血細胞的兔血清

5.2%綿羊紅血球

6.小試管、試管架、水浴鍋。

方法：

（-）預(yù)備試驗（示教說明）

預(yù)備試驗包括溶血素效價的滴定，補體效價的滴定，抗原效價的滴定

及被檢血清的處理。

（1）溶血素效價的滴定

按照下表加入各物

管號溶血素溶血素1：20生理2%羊血假定結(jié)果

（ml）稀釋倍數(shù)補體（ml）鹽水（ml）球（ml）

10.51：3000.31.70.5搖全溶解

20.51：5000.31.70.5勻全溶解

30.51：8000.31.70.5后全溶解

置

40.51：10000.31.70.5全溶解

37

50.51：12000.31.70.5全溶解

℃

60.51：16000.31.70.5全溶解

水

70.51：20000.31.70.5全溶解

浴

80.51：24000.31.70.5全溶解

90.51：32000.31.70.5全溶解

小

100.51：40000.31.70.5時,

110.51：48000.31.70.5

120.51：60000.31.70.5

對照10.32.20.5

凡最高稀釋度的溶血素可呈現(xiàn)完全溶血者為一個單位。依上表結(jié)果第

10管(即1：4000倍稀釋)0.5毫升溶血素為一個單位，在溶血反應(yīng)中常

用0.5毫升中含有2個溶血素單位的溶液，所以試驗時應(yīng)取1：2000倍稀

釋的溶液。

(2)補體單位滴定

依下表加入各試劑:

補體上理置溶血素2%羊血置

管抗原

(1：20)鹽水于(2單位)球懸液于結(jié)果

號(ml)

(ml)(ml)37(ml)(ml)37

10.200.51.30℃0.50.5℃不溶血

20.250.51.25水0.50.5水稍溶血

30.300.51.20浴0.50.5浴全溶血

40.350.51.15450.50.515全溶血

50.400.51.10分0.50.5分全溶血

60.450.51.05鐘0.50.5鐘全溶血

70.500.51.000.50.5全溶血

8-0.51.500.50.5不溶血

能引起完全溶血的最小補體量稱為準確單位，上表中第3管（即0.3

毫升），但因補體的效價可能有部分損失，故普通稍高的一管為實用單位,

實際試驗時須用兩個實用單位。

上表的結(jié)果為：

補體標準單位：0.3毫升

補體實用單位：0.35毫升

補體兩個實用單位：0.70毫升

因試驗時是兩個實用單位的補體0.5毫升，可依下列比例關(guān)系換算:

20：0.7=x：0.5

x=14.3

即須將補體稀釋14.3倍，用0.5毫升則含有兩個實用單位。

（3）抗原的滴定

在用已知抗原測定未知抗體時，必須先滴定抗原效價以決定本試驗時

所需抗原的最適濃度（反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗體效

1：5稀釋血清0.50.50.5————

傷寒抗原2U0.5——0.5———

痢疾抗原1：80—0.5————

補體2U0.50.50.50.50.50.5

生理鹽水——0.50.51.01.5

搖勻放置37℃水浴中30min

溶血素2U0.50.50.50.50.5——

2%羊血球0.50.50.50.50.50.5

搖勻放置37℃水浴中15min

特異性血清抗原溶血素羊血球

說明試驗管

對照對照對照對照對照

如血清對照管呈完全或部分不溶血是為抗補體現(xiàn)象。血清嚴重污染細

菌，混有淋巴液或顯著溶血時，常產(chǎn)生很強抗外體作用。又如試管、吸管

不清潔，也可出現(xiàn)抗補體。若有抗補體發(fā)生，應(yīng)抽血重試驗。

實驗五T、B淋巴細胞分離試驗

淋巴細胞主要分T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大亞群，它們具有不同的

特性和功能，為此在進行某些免疫學(xué)實驗時，首先需分離出純的T淋巴細

胞和B淋巴細胞。本試驗的原理為：淋巴細胞與用浪花二氨基異硫氨化物

（簡稱AET）處理的綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細胞

均能吸附AET-SRBC,形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán)，較正常未處理

的SRBC形成的E一花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性

好。再經(jīng)淋巴細胞分層液分離時，AET-E花環(huán)易沉于管底，而未形成E

一花環(huán)的T淋巴細胞，用低滲液解花環(huán)周圍的AET—SRBC,便可獲得

純T淋巴細胞，而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。

材料及試劑：

a）新鮮豚鼠血

b）兔紅細胞（RRBC）

c）浪花二氨基異硫氨化物（AET）

d）淋巴細胞分層液

e）其它Hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無菌生理鹽水，3.5%

氯化鈉溶液，離心機等。

方法：

1.AET—RRBC制備

（1）.AET溶液的制備

稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸微水中，使成為0.143M溶

液，用4NNaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。

（2）.AET處理RRBC

取洗滌好壓積的RRBC,按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制

的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。

取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。

連續(xù)洗滌3-5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET-RRBC粘附

成團，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再

洗一次，最后配成10%AET—RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。

（3）.1%AET—RRBC的配制：

將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC,以含10%

小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。

2.從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。

3.AET—E花環(huán)試驗：

將分離的單個核細胞（2xd/毫升）與等量1%AET—RRBC混合，置

37c水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2—3毫升，低

速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。

4.T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離

將形成E一花環(huán)的細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云

霧狀的細胞，即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底的E—花環(huán)，用Hanks

液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E—花環(huán)周圍的RRBC,

立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含

T淋巴細胞群。

實驗六豚鼠T淋巴細胞的測定

——兔紅細胞玫瑰花環(huán)試驗

玫瑰花環(huán)試驗，又稱為花結(jié)試驗。是測定淋巴細胞數(shù)量和功能的一種

方法。

人類T和B淋巴細胞表面具有不同的受體。由于人類T淋巴細胞表面

具有與綿羊紅細胞結(jié)合的受體，能與綿羊紅細胞非特異性結(jié)合，形成E花

環(huán)，因此，T細胞也成為紅細胞花瓣形成細胞。根據(jù)E—玫瑰花環(huán)形成率,

可以間接判斷機體細胞免疫力。目前，已廣泛應(yīng)用于臨床，作為測定人群

免疫狀態(tài)的一個指標。

材料：

1.肝素（100單位/毫升）

2.0.5%兔紅細胞懸液（用Hanks液配制）

3.吸收過的胎牛血清：

取經(jīng)56C30分鐘加熱滅活后的胎牛血清加半量壓積兔紅細胞混合后，

37℃水浴20分鐘，2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液即成。

4.Hanks液

5.豚鼠抗凝血

6.淋巴細胞分層液

7.滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。

方法：

1.淋巴細胞提取

（1）取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。加于3

毫升淋巴細胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。

（2）2000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，吸淋巴細胞層到另一試管中加5倍

體枳的Hanks液洗1—2次，（1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘）棄上清即成。

圖8用分層液離心后的血細胞層

2.加吸收過的胎牛血清0.1毫升，0.5%兔紅細胞懸液0.2毫升，于

淋巴細胞中。混合后，37c水浴5分鐘。

3.500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，放4c冰箱中2小時后，棄大部分上清。

4.染色及觀察

輕輕懸浮沉積的細胞。向懸液中滴一滴美蘭液，混合，10分鐘后取一

滴放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。

高倍鏡或油鏡下計數(shù)200個淋巴細胞，凡結(jié)合3個或3個以上的兔紅

細胞者為陽性，計算花環(huán)形成細胞的百分率。

實驗七酶聯(lián)免疫吸附試驗

(ELISA)測定傷寒桿菌“O”抗體

酶聯(lián)免疫吸附試驗是用酶標記的抗體(或SPA)檢測未知抗原或抗體

的方法。此法敏感性高，特異性強。常用的是ELISA方法，間接法，雙抗

體法和抗原法。本次試驗介紹，醐聯(lián)葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA

法原理如下，見圖9

圖9ELISA-SPA法原理

1.加抗原使之吸附于固相載體(如塑料反應(yīng)板)

2.洗滌加待測血清

3.洗滌加酶標記SpA

4.洗滌加酶的底物。經(jīng)酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

材料：

1.聚乙烯塑料反應(yīng)板(PH9.6時可吸附蛋白Ag)

2.抗原：傷寒桿菌0901煮沸或超聲波粉碎抗原

3.待測血清

4.凍干酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白(HRD—proteinA)純品

5.鄰苯二胺(OPD)

6.包被液：0.05M碳酸鈉一碳酸氫鈉溶液PH9.6

7.稀釋液：10%免疫血清PBS一吐溫20,防止非特異性吸附

8.洗滌液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特異性吸附

9.底物溶液：0.02M磷酸氫二鈉25.7毫升

0.1M檸檬酸24.3毫升

蒸鐳水50毫升

臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入

30%雙氧水0.15毫升，底物對光敏感，需要避光并立即使用。

10.終止液；2M硫酸

方法：

1.抗原包被

取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，于每孔內(nèi)加傷寒抗原01毫升（用包

被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置37C1小時，棄抗原液，用洗

滌液3次每次3分鐘。

2.加待測血清

于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度（如1：5,1：10,1：20-1：80）的待

測血清,PBS空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各0.1毫升。置37℃30

分鐘，洗滌3次。

3.加酶聯(lián)A蛋白

于每孔加前聯(lián)A蛋白各0.1毫升，置37℃20分鐘，洗滌3次。

4.加臨時配制的底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2M碳酸1

滴終止反應(yīng)。

5.結(jié)果判斷：（肉眼判斷）

若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據(jù)顏

色深淺以（+）表示。

綜合設(shè)計性實驗

實驗一抗體產(chǎn)生細胞的檢測——溶血空斑實驗

（綜合性實驗）

取綿羊細胞免疫的小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，與一定量的指示細胞

（綿羊細胞）和補體結(jié)合，注入自制的小室內(nèi)，經(jīng)37℃孵育后，單個散在

的抗體形成釋放抗體，抗體與周圍的綿羊紅細胞（抗原）結(jié)合，并在補體

參與下，使綿羊細胞溶解，結(jié)果在抗體形成細胞周圍形成肉眼可見的圓形

透明溶血區(qū)——溶血空斑。計算溶血空斑數(shù)目，則可推算脾內(nèi)存在的抗體

產(chǎn)生細胞總數(shù)。

材料：

1.20—22克健康小鼠

2.解剖器械

3.注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽

4.20%綿羊紅細胞懸液

5.潔凈脫脂載玻片（75x25毫米），蓋玻片（22x22毫米）。

6.Ph7.2的Hanks液，凡士林油。

7.微量