DB12T 505-2014 玉米轉(zhuǎn)基因成分篩查方法

65.020.01B

04

DB12

天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB12/T

505—2014前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T1.1—2009

本標(biāo)準(zhǔn)由天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃鳳軍、李建、趙新、陳杰、易萌、朱珠、馬強、楊炳存。本標(biāo)準(zhǔn)

2014

年

04

IDB12/T

505—2014玉米轉(zhuǎn)基因成分篩查方法1

范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性

篩查的術(shù)語和定義、檢測方法、結(jié)果分析與表述。本標(biāo)準(zhǔn)適用玉米及其制品中

zSSIIb

內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因、CaMV35S

Bt

bar基因、

基因的定性

篩查檢測2

規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T

672 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測 農(nóng)業(yè)部

2031

號公告—19—2013

農(nóng)業(yè)部

1485

號公告—4—2010 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 DNA

提取和純化3

術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1

基因

gene編碼玉米淀粉合酶異構(gòu)體

Ⅱ-2

3.2CaMV35S

啟動子

35S

promoter

from

mosaic

（CaMV）來自花椰菜花葉病毒的

35S

3.3NOS

終止子

of

（NOS）

來自胭脂堿合成酶基因

NOS

的終止子。3.4

基因

（

）來源與蘇云金芽胞桿菌（

thuringiensis），可表達(dá)一種殺蟲晶體蛋白的基因，常見的基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、融合基因。3.5bar

基因

resistance

hygroscopicus，PAT）。該酶具有對除草劑草丁膦（）的耐受性。3.6HPT

基因 HPT

來源于大腸桿菌或鏈球菌（

），編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（）的基因。1檢測基因引物序列擴增片段長度基因性質(zhì)zSSIIb

：5′-

：5′-

151

bp內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因CaMV35S35S

：35S

：195

bp外源基因NOSNOS

：NOS

：180

bp外源基因BtBt

：5′-

Bt

：5′-

301

bp外源基因barbar

：5′-

bar

：5′-

262

bp外源基因DB12/T

505—20144

檢測方法4.1

試劑和材料4.1.1

GB/T

6682

4.1.2

4.1.3

10

g/L

稱取

1.0

g

溴化乙錠（EB），溶于

水中，避光保存。注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時應(yīng)戴一次性手套操作并妥善處理廢液。4.1.4

10

氫氧化鈉溶液：在

160

水中加入

80.0

g

氫氧化鈉（NaOH到

200

。4.1.5

500

稱取

18.6

g

EDTA-Na加入

70

溶液（4.1.4）調(diào)

至

8.0

100

。在

103.4

（121

20

。4.1.6

1

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（

稱取

g

三羥甲基氨基甲烷（）溶解于

800

至

8.0

1

000

103.4

（121

20。4.1.7

TE

8.0）：分別量取

三羥甲基氨基甲烷-4.1.6

2

乙二銨四乙酸二鈉溶液（

1

000

。在

103.4

（121

20

。4.1.8

50×

緩沖液：

242.2

g

300

水加熱攪拌溶解后，加

100

乙二銨四乙酸二鈉溶液（4.1.5

至

8.0

1

。使用時用水稀釋成

1×。4.1.9

稱取

10

12

h

250.0

二甲基苯腈藍(lán)，用

10

水溶解；稱取

50.0

g

蔗糖，用

30

水溶解。混合以上三種溶液，加水定容至

100，在

4

℃下保存。4.1.10

分子量標(biāo)準(zhǔn)：

50

bp～1

000

bp

的

DNA

片段。4.1.11

混合溶液：

10

的

、、dGTP、

四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合。4.1.12

Taq

25

氯化鎂溶液。4.1.13 引物：玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和轉(zhuǎn)基因玉米外源基因檢測時所用的引物序列見表

1。表1

2試劑終濃度體積水——10×PCR

緩沖液1×2.5

μL

hpt

：5′-

hpt

：5′-

472

bp

hpt

：5′-

DB12/T

505—2014外源基因4.1.14

引物溶液：用

緩沖液（）或水分別將上述引物稀釋到

10

μ。4.1.15 石蠟油。4.1.16

4.1.17

提取試劑盒。4.2

儀器4.2.1

分析天平：

0.1

g

和

0.1

。4.2.2

升降溫速度>1.5

℃<1.0

℃。4.2.3

電泳槽、電泳儀等電泳裝置。4.2.4

紫外透射儀。4.2.5

4.2.6

4.2.7

其他相關(guān)儀器設(shè)備。4.3

4.3.1

抽樣按

NY/T

672

和農(nóng)業(yè)部

號公告—19—2013

規(guī)定的執(zhí)行。4.3.2

按

NY/T

672

和農(nóng)業(yè)部

號公告—19—2013

規(guī)定的執(zhí)行。4.3.3

試樣預(yù)處理按農(nóng)業(yè)部

4—

規(guī)定的執(zhí)行。4.3.4

按農(nóng)業(yè)部

4—

規(guī)定的執(zhí)行。4.3.5

4.3.5.1

反應(yīng)4.3.5.1.1

反應(yīng)設(shè)置

3

4.3.5.1.2 在

反應(yīng)管中按表

2

25

μL

表2

PCR檢測反應(yīng)體系3基因名稱變性擴增循環(huán)次數(shù)最終延伸zSSIIb94

℃，5

94

℃，30

s58

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

CaMV35S94

℃，5

94

℃，30

s60

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

NOS94

℃，5

94

℃，30

s60

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

Bt95

℃，5

94

℃，1

56

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

bar95

℃，5

94

℃，30

s63

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

95

℃，5

94

℃，30

s60

℃，30

s72

℃，30

s3572

℃，7

25

mmol/L氯化鎂溶液1.5

mmol/L1.5

μLdNTPs

混合溶液（各

2.5

mmol/L）各

0.2

mmol/L2.0

μL10

μmol/L上游引物0.5

μ0.25～1.25

μL10

μmol/L下游引物0.1～5

μmol/L0.25～1.25

μL

酶0.025

μL——25

DNA模板2

2.0

μL總體積25.0

μL根據(jù)

酶的濃度確定其體積，并相應(yīng)調(diào)整水的體積，使反應(yīng)體系總體積達(dá)到

μL。如果

PCR

緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，加等體積水。注

1

PCR

和

0.2μ；CaMV35S

啟動子

PCR

檢測反應(yīng)體系中，上下游引物分別是

和

35S-R，引物終濃度分別為0.4μ；NOS終止子PCR和0.4μ；Bt

基因

PCR

和

Bt-R

0.5μ；bar

基因

PCR

檢測反應(yīng)體系中，上、下游引物分別是

和

，引物終濃度分別為

0.2μmol/L；

基因

PCR

檢測反應(yīng)體系中，上下游引物分別是

和

，引物終濃度分別為0.2μmol/L。DB12/T

505—20144.3.5.1.3 將

管放在離心機上，

000

g

離心

10

s，然后取出

管，放入

DB12/T

505—2014中。4.3.5.1.4 進(jìn)行

反應(yīng)。反應(yīng)程序按表

3

表3

PCR反應(yīng)程序4.3.5.1.5 反應(yīng)結(jié)束后取出

管，對

4DB12/T

505—20144.3.5.2

反應(yīng)在試樣

以非轉(zhuǎn)基因玉米基因組

DNA

CaMV35S、、Bt、bar、

基因的轉(zhuǎn)基因玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

DNA

作為陽性對照；以水作為空白對照。各對照

反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及

反應(yīng)條件與

4.3.6

按

20

1×

瓊脂糖溶液中加入

5

μL

EB

溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝

1×

12

μL

產(chǎn)物與

3

μL

加樣緩沖液

DNA

2

V/cm條件下電泳檢測。4.3.7

凝膠成像分析電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀上成像。根據(jù)

DNA

分子量標(biāo)準(zhǔn)

擴增片段是否為目的

DNA

片段，按照

和

4.3.9

的規(guī)定執(zhí)行。4.3.8

按

產(chǎn)物回收試劑盒說明書，回收

擴增的

片段。4.3.9

將回收的

產(chǎn)物克隆測序，與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

zSSIIb、CaMV35S、NOS、Bt、bar、

基因序列（參見附錄

A）進(jìn)行比對，確定

片段是否為目的

DNA

片段。5

結(jié)果分析與表述5.1

陽性對照的

反應(yīng)體系正常。否則表明

反應(yīng)體系不正常，需要查找原因重新檢測。5.2

樣品檢測結(jié)果分析和表述5.2.1 在試樣的

反應(yīng)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致；而CaMV35S

NOS

Bt

基因、

基因均未得到擴增，或擴增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出轉(zhuǎn)基因成分。結(jié)果表述為“試樣中未檢測出

啟動子、NOS

Bt

bar

5.2.2

反應(yīng)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致；啟動子、

Bt基因、

基因和

段大小一致，表明試樣中檢測出轉(zhuǎn)基因成分。結(jié)果表述為“試樣中檢測出

5DB12/T

505—2014附錄A（資料性附錄）A.1

基因擴增產(chǎn)物核苷酸序列1

CTCCCAATCC

TTTGACATCT

GCTCCGAAGC

AAAGTCAGAG

CGCTGCAATG

CAAAACGGAA61

CGAGTGGGGG

CAGCAGCGCG

CGGACCCAAA

GCTGATCATC121

CATCAGCTCC

TGTCACCAAG

AGAGAAATCG

A注A.2

CaMV35S啟動子擴增產(chǎn)物核苷酸序列1

GCTCCTACAA

ATGCCATCAT

TGCGATAAAG

GAAAGGCTAT

CATTCAAGAT

GCCTCTGCCG61

ACAGTGGTCC

CAAAGATGGA

CGTGGAAAAA

GAAGACGTTC121

CAACCACGTC

TTCAAAGCAA

GTGGATTGAT

CACTGACGTA

AGGGATGACG181

CACAATCCCA

注A.3

終止子擴增產(chǎn)物核苷酸序列1

GAATCCTGTT

GCCGGTCTTG

CGATGATTAT

CATATAATTT

CTGTTGAATT

ACGTTAAGCA61 TGTAATAATT

AACATGTAAT

TGGGTTTTTA

TGATTAGAGT121 CCCGCAATTA

TACATTTAAT

ACGCGATAGA

TAGCGCGCAA

ACTAGGATAA注：劃線部分為引物序列注：劃線部分為引物序列A.4

基因擴增產(chǎn)物核苷酸序列1

GAAGGTTTGA

GCAATCTCTA

CCAAATCTAT

GCAGAGAGCT

TCAGAGAGTG

GGAAGCCGAT61

CCTACTAACC

CAGCTCTCCG

TCAACGACAT

GAACAGCGCC121

TTGACCACAG

CTATCCCATT

GTTCGCAGTC

AAGTTCCTCT

CTTGTCCGTG181

TACGTTCAAG

CAGCTAATCT

TCACCTCAGC

ACGTTAGCGT

GTTTGGGCAA241

AGGTGGGGAT

TCGATGCTGC

AACCATCAAT

ACGACCTTAC

TAGGCTGATC301

G注A.5

bar基因擴增產(chǎn)物核苷酸序列1

GAAGGCACGC

AACGCCTACG

ACTGGACGGC

CGAGTCGACC

GTGTACGTCT

CCCCCCGCCA61 CCAGCGGACG

GGACTGGGCT

CTGAAGTCCC

TGGAGGCACA121 GGGCTTCAAG

AGCGTGGTCG

CTGTCATCGG

GACCCGAGCG

TGCGCATGCA181 CGAGGCGCTC

GGATATGCCC

CCCGCGGCAT

GCCGGCTTCA

AGCACGGGAA241

CTGGCATGAC

GTGGGTTTCT

GG6DB12/T

505—2014注A.6

HPT基因擴增產(chǎn)物核苷酸序列1

GAAGTGCTTG

ACATTGGGGA

GTTTAGCGAG

AGCCTGACCT

ATTGCATCTC

CCGCCGTGCA61

CAGGGTGTCA

CGTTGCAAGA

CCGCTGTTCT

ACAACCGGTC121

GCGGAGGCTA

TGGATGCGAT

CGCTGCGGCC

AGACGAGCGG

GTTCGGCCCA181

TT