DB21T-紅托竹蓀液體菌種生產技術規(guī)程

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB21/TXXXX—2024目次TOC\o"1-1"\h\t"標準文件_一級條標題,2,標準文件_附錄一級條標題,2,"前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14生產技術要求 25生產工藝流程 36母種制備 37搖瓶液體菌種生產技術 38發(fā)酵罐液體菌種生產 49放罐接種 510液體菌種貯藏 611記錄與存檔 6附錄A 7附錄B 8附錄C 9前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB21/TXXXX《液體菌種生產技術規(guī)程》的第5部分。DB21/TXXXX已發(fā)布或計劃發(fā)布以下部分：——第1部分：平菇；——第2部分：金針菇；——第3部分：大球蓋菇；——第4部分：長根菇；——第5部分：紅托竹蓀；——第6部分：滑菇；…………請注意本文件某些內容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本文件由遼寧省農業(yè)農村廳提出并歸口管理。本文件起草單位：遼寧省微生物科學研究院、遼寧蘑磨達食用菌科技有限公司。本文件起草人：韓冰、陳飛、鐘麗娟、桓明輝、冀寶營、于廣峰、柴林山、蘇明禮、王建民、章翰天、王洪奇、李豐碩、孫玉祿。本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農業(yè)農村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯系電話本文件起草單位通訊地址：遼寧省微生物科學研究院（朝陽市雙塔區(qū)龍山街四段820號），聯系電話液體菌種生產技術規(guī)程第5部分：紅托竹蓀范圍本文件規(guī)定了紅托竹蓀（學名為紅托鬼筆，Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel）液體菌種的術語和定義、生產基本要求、生產工藝流程、搖瓶液體菌種生產技術、發(fā)酵罐菌種生產技術、放罐接種等內容。本文件適用于紅托竹蓀液體菌種的生產。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150壓力容器GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準GB50073潔凈廠房設計規(guī)范GB/T12728食用菌術語NY/T528食用菌菌種生產技術規(guī)程NY/T1731食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范NY/T1742食用菌菌種通用技術要求NY/T1846食用菌菌種檢驗規(guī)程術語和定義GB/T12728和NY/T528界定的術語和定義適用于本文件。3.1紅托竹蓀Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel紅托竹蓀（學名為紅托鬼筆，Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel），又稱織金竹蓀，隸屬真菌門Eumycota、擔子菌亞門Basidiomycotina、腹菌綱Gasteromycetes、鬼筆目Phallales、鬼筆科Phallaceae、鬼筆屬Phallus。3.2固體菌種solidspawn在玻璃試管、培養(yǎng)皿或聚丙烯瓶等固體培養(yǎng)基內生長的純食用菌菌絲體培養(yǎng)物。3.3液體菌種liquidspawn用于生產和銷售的菌絲體及其生長基質組成的液體繁殖材料，包括搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐液體菌種。3.4液體菌種發(fā)酵罐cultivationapparatusforliquidspawn進行液體菌種培養(yǎng)的專用發(fā)酵設備，應符合GB150要求。3.5發(fā)酵罐空消emptyfermentersterilization對尚未加水投料的空發(fā)酵罐進行高壓滅菌。3.6發(fā)酵罐實消fermentersterilization對投料后的發(fā)酵罐進行高壓蒸汽滅菌。3.7罐壓jarpressure在液體菌種發(fā)酵制備過程中發(fā)酵罐內保持的空氣壓力（表壓），單位：MPa。3.8通風量ventilationvolume液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入發(fā)酵罐中無菌空氣體積與發(fā)酵罐實際料液體積的比例。用V/V表示。生產技術要求4.1人員要求具有食用菌菌種生產從業(yè)資格的人員，包括檢驗人員，操作符合NY/T1731要求。4.2場地環(huán)境要求生產場地符合NY/T528的要求，場地開闊、交通方便、水源和電源充足、路面硬化、衛(wèi)生清潔、排水良好，遠離畜禽養(yǎng)殖場、排污口、工礦業(yè)“三廢”及微生物、煙塵和粉塵等污染源。4.3生產車間要求液體菌種生產車間應包含原料庫、配料間、滅菌室、冷卻間、接種間、培養(yǎng)室、化驗室、菌種室等，并配備相應設施設備，規(guī)模配套，布局合理，設計符合GB50073要求。車間地面要具備防水、防腐、防滲漏、防滑性能，易清洗，應有1.0°~1.5°的排水坡度和良好的排水系統(tǒng)。墻壁和天花板應具有防潮、防霉、防水性能。門窗應設置防蚊蠅紗網。車間安裝排氣管道或者排風設備。車間設封閉式廢物桶。4.4主要生產設備要求應具有磅秤、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、液體菌種接種器、超凈工作臺、調溫設備、除濕設備、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床或磁力攪拌器、冰箱、顯微鏡等滅菌設備及常規(guī)用具。壓力容器應經政府有關部門檢驗合格，符合GB150要求。應具有備用電源。4.5生產原料化學試劑類、生物制劑及天然材料類應符合NY/T528要求，同時水不溶物物料需過40目篩；生產用水應符合GB5749要求。生產工藝流程工藝流程見圖1圖1液體菌種生產工藝流程母種制備按照附錄A.1配方制備培養(yǎng)基，母種培養(yǎng)操作流程應符合NY/T528要求，并按NY/T1846規(guī)定抽樣，進行感官檢驗和菌絲微觀特征檢驗，合格菌種進入生產流程。母種質量要求符合NY/T1742關于母種質量的規(guī)定。搖瓶液體菌種生產技術7.1液體培養(yǎng)基的制作7.1.1培養(yǎng)基配制與分裝按照附錄A.2配方配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)物料先用水攪拌均勻后，裝入搖瓶中，裝液量為150mL/500mL，瓶口用12~16層紗布塞封口，外用15cm×15cm聚丙烯膜或牛皮紙包扎，并用線繩扎緊。7.1.2滅菌將分裝好的三角瓶放入滅菌鍋內，鍋內留有一定的空隙。檢查鍋內水位，立即滅菌。滅菌蒸汽壓力升至0.1MPa~0.12MPa，溫度達121℃時，滅菌30min。7.1.3冷卻將滅菌后的液體培養(yǎng)基放入超凈工作臺中，冷卻至室溫。7.2接種在超凈工作臺中嚴格按無菌操作規(guī)程，將合格的母種斜面菌絲體切割成（3~5）mm×（3~5）mm的菌塊，接種到已冷卻的搖瓶液體培養(yǎng)基中，每150mL液體培養(yǎng)基中接入20塊~30塊。接種完成后及時貼好標簽，即為一級液體菌種。取檢測合格的一級液體菌種，按照10%的接種量接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)可制備二級液體菌種。7.3培養(yǎng)菌種培養(yǎng)溫度26℃，避光振蕩培養(yǎng)，搖床轉速150r/min。每日檢查生長狀態(tài)，及時檢出不合格菌種。搖瓶靜置1min后，菌絲球體積占比液體培養(yǎng)基體積的80%以上，可結束培養(yǎng)。培養(yǎng)時間約為15d左右。7.4搖瓶菌種檢驗期間每天觀察，及時去除污染菌種。培養(yǎng)液應澄清透明，無雜菌、無異味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常；菌絲球、菌絲片段密集，菌球均勻懸浮于液體培養(yǎng)基中不分層。7.5入庫與記錄完成培養(yǎng)的搖瓶液體菌種應登記入庫。搖瓶液體菌種生產各環(huán)節(jié)應詳細記錄。7.6留樣菌種應留樣備查，留樣的數量應以每個批號3份~5份，于4℃下貯存，貯存至經發(fā)酵罐菌種轉接的菌棒出菇結束為止。發(fā)酵罐液體菌種生產8.1空氣過濾器的檢查使用前應拆分檢查空氣過濾器濾芯，要求無油污、料污、無破損，外殼內外壁要求無污物、光亮潔凈。8.2發(fā)酵罐檢查與清洗檢查罐上全部閥門、壓力表，要求完好、工作正常。對罐體內、外和全部閥門用流水進行沖洗，達到無死角、內壁無任何培養(yǎng)料殘余物的潔凈程度。8.3空消滅菌發(fā)酵罐空消條件：罐體壓力0.120Mpa~0.140Mpa、溫度達121℃~126℃時，高壓蒸汽滅菌30min。發(fā)酵罐初次使用、出現雜菌、長期放置、更換品種等情況出現其一時，需進行間歇空消，即空消一次后間隔2h~3h再空消一次。8.4投料定容將配制好的液體培養(yǎng)基原料充分溶解，加適量溫水攪拌均勻，倒入或用泵抽入發(fā)酵罐中，加水定容至所需體積（液體培養(yǎng)基占罐體總容積的70%），擰緊上料口蓋。8.5實消與冷卻投料定容完成后，利用外源蒸汽實消滅菌。滅菌條件：罐壓0.120Mpa~0.140Mpa、滅菌溫度121℃，滅菌時間30min。實消滅菌結束后將冷水通入發(fā)酵罐夾層或者內置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)，使液體培養(yǎng)基降溫至26℃以下。降溫過程中及時向發(fā)酵罐內通無菌空氣防止罐壓回零。8.6接種利用火焰保護接種法接入搖甁菌種，接種量為5~10%。把火圈放在投料口的上方點燃，此時打開進料口蓋，把搖瓶液體菌種迅速投入罐中，迅速蓋好進料口蓋、擰緊。移走火焰圈，液體菌種進入培養(yǎng)階段。8.7培養(yǎng)培養(yǎng)時控制進氣閥的無菌空氣通風量1：1V/V、罐壓保持在0.02Mpa~0.05Mpa之間、培養(yǎng)溫度26℃。培養(yǎng)約10d后，發(fā)酵罐菌種即可達到放罐指標。8.8留樣、取樣及檢測8.8.1留樣、取樣留存搖瓶液體菌種樣品，發(fā)酵罐滅菌后的空白培養(yǎng)基樣品，定期取樣，進行鏡檢和無菌檢測，上述樣品應放4℃冰箱內保存一周以上。8.8.2檢測培養(yǎng)過程中定期從發(fā)酵罐中取出樣品應及時鏡檢與無菌檢測，同時確定菌絲生長發(fā)育狀態(tài)與排除雜菌污染。a)按照GB4789.28中的規(guī)定，接種后置于28℃~30℃恒溫培養(yǎng)24h~48h，觀察是否有細菌污染，同時進行鏡檢和感官檢測。b)按照GB4789.28中的規(guī)定，接種后置于23℃~25℃恒溫培養(yǎng)48h~72h，觀察是否有霉菌污染，同時進行鏡檢和感官檢測。8.9發(fā)酵罐菌種放罐指標發(fā)酵罐菌種放罐感官與理化指標見附錄B。放罐接種液體菌種達到放罐指標并經鏡檢等檢驗合格后即可放罐。使用液體菌種接種器將液體菌種注入菌棒。按照接種器接種規(guī)程，接種動作迅速、準確，接種量為25mL~30mL/菌棒（17cm×33cm）。液體菌種臨時儲存液體菌種生產后應及時使用，如不能及時使用，需進行儲存。在發(fā)酵罐內通入無菌空氣，保持罐壓0.02Mpa~0.05Mpa時，料溫4℃保存小于6d。記錄與存檔母種、搖瓶液體菌種和發(fā)酵罐液體菌種生產的每個環(huán)節(jié)（如：滅菌、培養(yǎng)、檢測環(huán)節(jié)）都要有詳實的記錄，由具體操作人員現場填寫，定期審核，簽字后歸檔保存，檔案應保存3年以上。

（資料性）紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)基建議配方A.1母種培養(yǎng)基配方（1L）：柞木屑20g（小于40目，加水1.1~1.2L煮沸15~20min，4層紗布過濾）、葡萄糖20g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、瓊脂20g，加水定容至1L，pH自然。A.2液體培養(yǎng)基配方（1L）：柞木屑40g（小于40目，加水1.1~1.2L煮沸15~20min，4層紗布過濾），紅糖30g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，加水定容至1L，pH自然。

（規(guī)范性）放罐指標放罐感官指標參見表B.1，放罐理化指標參見表B.2。表B.1放罐感官指標項目要求菌液色澤菌絲球或菌絲片段呈淡黃色，菌液呈淡黃色至淺棕色菌液形態(tài)菌液粘稠、半透明，菌絲球、菌絲片段均勻懸浮于液體中，不分層菌液氣味有紅托竹蓀液體培養(yǎng)時特有的香氣，無酸、臭等異味，發(fā)酵罐排氣口氣味正常，無明顯改變表B.2放罐理化指標理化指標要求pH3.0~5.0菌絲濕重（g/mL）≥0.15顯微鏡下菌絲形態(tài)可見紅托