機(jī)能實驗設(shè)計書

【研究題目】鈣通道阻滯藥（CCBs）與非甾體類抗炎藥（NSAIDs）聯(lián)合應(yīng)用治療痛風(fēng)（gout）急性發(fā)作的優(yōu)勢【研究目的】制備高尿酸血癥與低溫誘發(fā)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型驗證文獻(xiàn)報導(dǎo)的鈣通道阻滯藥對痛風(fēng)的治療效果，觀察非甾體類抗炎藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效與其不良反應(yīng)觀察兩藥聯(lián)合應(yīng)用時是否可以減少NSAIDs的不良反應(yīng)并增加療效【理論依據(jù)及研究現(xiàn)狀】一、痛風(fēng)(gout)是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸產(chǎn)生過多及(或)尿酸排泄減少，在體內(nèi)析出結(jié)晶、蓄積沉積所致的一組代謝性疾病。臨床主要表現(xiàn)為高尿酸血癥、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石等，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)畸形及腎損害。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是成年男性最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，也是痛風(fēng)患者就醫(yī)的最主要原因。急性發(fā)作時，尿酸鈉(MSU)微晶體沉積于關(guān)節(jié)而引起局部粒細(xì)胞浸潤及炎癥反應(yīng)，如未及時治療可發(fā)展為慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎或腎病變。隨著我國生活水平的提高，人們攝入高嘌呤食物日益增多，痛風(fēng)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢【1】，據(jù)NHIS研究結(jié)果顯示，亞洲以我國臺灣地區(qū)痛風(fēng)患病率居高，達(dá)11.7%【2】。此外，痛風(fēng)與高血壓、高脂血癥等疾病的發(fā)生也有密切相關(guān)性【3】，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一種代謝性疾病。二、目前臨床上有許多防治痛風(fēng)的藥物,但由于部分藥物適應(yīng)癥限制及不良反應(yīng)較多,患者常因不能忍受而停止治療，導(dǎo)致痛風(fēng)仍不能得到很好的控制【4】，例如：別嘌呤醇(Allopurinol)可有效抑制尿酸生成，但由于嚴(yán)重毒性而不適用于腎功能損傷、排泄不足的病人【5】；丙磺舒(probenecid)、苯溴馬隆(Benzbromaron)等可促進(jìn)尿酸排泄，但易引起尿酸鹽結(jié)晶的尿路沉積而致腎損害【6】；尿酸酶類藥物價格昂貴【7】；秋水仙堿（Colchicine）可抑制白細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)、減少急性痛風(fēng)局部粒細(xì)胞浸潤，但由于治療劑量與中毒劑量十分接近，胃腸道反應(yīng)、肝細(xì)胞壞死等不良反應(yīng)多見【8】；非甾體類抗炎藥（NSAIDs）是治療急性痛風(fēng)的首選藥物。炎癥反應(yīng)時損傷因子可使前列腺素（PG）合成增加，導(dǎo)致血管擴(kuò)張、組織水腫，并與緩激肽等協(xié)同產(chǎn)生致炎作用。吲哚美辛、萘普生、舒林酸等NSAIDs通過抑制環(huán)氧化酶（COX）活性、減少PG合成而發(fā)揮抗炎、縮血管作用。但NSAIDs治療關(guān)節(jié)炎時，由于需要長期大量給藥，不良反應(yīng)的發(fā)生率很高【9】，常導(dǎo)致：胃粘膜血流減少、胃粘液分泌減少、胃酸增多，進(jìn)而引起消化性潰瘍和胃腸道出血穿孔，最為常見；腎血流量減少，長期使用可導(dǎo)致慢性腎炎和腎乳頭壞死；心律不齊、血壓升高、心悸等心血管不良反應(yīng)；選擇性COX-2抑制藥的胃腸道反應(yīng)較輕，但其心血管不良反應(yīng)仍顯著。三、隨著治療經(jīng)驗的積累，和對各種藥物的局限性及不良反應(yīng)的深入了解,尋找療效更佳、不良反應(yīng)更小的新藥或新的治療方法一直是痛風(fēng)治療研究的熱點。近年來國外研究發(fā)現(xiàn)【10】，長效鈣通道阻滯藥(CCBs)如硝苯地平和西尼地平，除了能夠擴(kuò)張外周血管治療高血壓，還能減少高血壓等原因引起的骨骼肌低氧環(huán)境下肌細(xì)胞中尿酸前體物質(zhì)的生成，具有降低血漿尿酸濃度的作用，故可以用來治療痛風(fēng)。高血壓既是痛風(fēng)最常見的合并癥之一，也是痛風(fēng)發(fā)生的獨立風(fēng)險因素，因此長效CCBs對伴有高血壓的痛風(fēng)的治療作用頗具應(yīng)用價值，并且CCBs還具有相對安全、不良反應(yīng)較輕的優(yōu)點。受該結(jié)果啟發(fā)，本實驗將CCBs的藥理作用與NSAIDs的不良反應(yīng)進(jìn)行比對，還發(fā)現(xiàn)CCBs具有減少NSAIDs諸多不良反應(yīng)的潛在可能性：①據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)【11】，CCBs可舒張胃粘膜血管、增加胃粘膜血流量，并降低胃壁肌張力和收縮力、抑制胃酸分泌，或可對抗NSAIDs引起的消化性潰瘍。②CCBs的舒血管作用可增加腎血流量，對腎臟具有保護(hù)作用【12】，或可減輕NSAIDs引起的腎臟損害③CCBs作為常用的抗高血壓藥和抗心律失常藥，可對抗NSAIDs引起的血壓升高、心悸等不良反應(yīng)。此外，據(jù)報道CCBs與NSAIDs合用還可使硝苯地平、維拉帕米的血藥濃度升高。但是二者合用也可能會導(dǎo)致胃腸道出血加重。因此，若本實驗證實兩藥合用時不會影響各自的療效，且CCBs能夠確實減少NSAIDs引起的消化性潰瘍等不良反應(yīng)，同時不引起新的不良反應(yīng)，將有可能為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療提供一個新的可能。四、目前常用的痛風(fēng)模型主要有兩大類，一為單純的高尿酸血癥模型，二為關(guān)節(jié)腔注射尿酸鹽誘發(fā)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，但兩種模型都只涉及人類痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制的一部分。本實驗采用了今年3月報導(dǎo)的次黃嘌呤重復(fù)灌胃加冰敷法誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型【13】，該模型能較好的模擬高尿酸血癥人類在低溫環(huán)境下誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，且為本實驗同時研究CCBs降低血尿酸的作用與NSAIDs治療關(guān)節(jié)炎的作用提供了方便?！狙芯績?nèi)容】制備高尿酸血癥和低溫誘發(fā)的的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，以西尼地平為例驗證CCBs降低血尿酸的作用，以吲哚美辛為例觀察NSAIDs對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效及其不良反應(yīng)，并觀察兩藥聯(lián)合應(yīng)用時是否可以減少NSAIDs的不良反應(yīng)并增加療效?！狙芯糠椒ā繉嶒瀸ο螅?0只12周齡SD大鼠，雄性，體重（200±20）g器材及藥品：鼠籠、電子分析天平、灌胃針、模板、紗布、氣球、冰塊、次黃嘌呤、西尼地平、吲哚美辛、游標(biāo)卡尺、尿酸試劑盒、大鼠手術(shù)器材等實驗組與對照組的處理：60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白對照組、模型對照組、西尼地平治療組、吲哚美辛治療組和聯(lián)合用藥組。除空白對照組外，均制備成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。西尼地平治療組給予西尼地平，吲哚美辛治療組給予吲哚美辛，聯(lián)合用藥組合用兩藥，空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水。觀察指標(biāo)：測量大鼠右下肢最大直徑變化，觀察大鼠步態(tài)并進(jìn)行評分【14】，麻醉后眼球取血測量血尿酸濃度，并取關(guān)節(jié)滑膜做病理檢查【15】，用以評估動物模型的制備以及抗痛風(fēng)藥物的治療效果測量血壓與心率變化，處死后取胃和小腸進(jìn)行大體損傷評價【16】，用以評估NSAIDs單用時的不良反應(yīng)以及兩藥合用時CCBs的作用?！緦嶒灢襟E】1、50只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、西尼地平治療組、吲哚美辛治療組和聯(lián)合用藥組。2、空白對照組不做處理，自由攝食、自由飲水；其他4組稱重，以５％次黃嘌呤溶液10ml/（kg*d）灌胃7d制備高尿酸血癥，每次灌胃半小時后均將大鼠以仰臥位包裹固定，用裝有冰水混合物的小氣球以紗布固定冰敷右下肢膝關(guān)節(jié)2h，誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。3、每日冰敷完1h后，關(guān)節(jié)屈位，測量右下肢最大直徑，每只大鼠取右下肢最大徑與左下肢最大徑的差值。每日冰敷完2h后觀察大鼠步態(tài)并評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為：正常行走記0分；輕微跛行，即右下肢略有彎曲，記1分；跛行，即右下肢可觸及地面但明顯彎曲，記2分；重度跛行，即右下肢不觸及地面，僅三足行走，記3分。4、第3d開始給藥，稱重后，西尼地平治療組以西尼地平1mg/（kg*d）灌胃，吲哚美辛治療組以吲哚美辛3mg/（kg*d）灌胃，聯(lián)合用藥組合用上述劑量的西尼地平、吲哚美辛灌胃；空白對照組、模型對照組灌服等量生理鹽水。5、第4d（24h后），每組大鼠各取5只，眼球取血收集血清，按照尿酸試劑盒說明測定血清中尿酸含量；同時取右下肢膝關(guān)節(jié)滑膜，固定于10%福爾馬林內(nèi)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。剩余大鼠繼續(xù)給藥直至第7d，每天測關(guān)節(jié)直徑，觀察步態(tài)，并測量血壓和心率。6、末次給藥24h后，剩余小鼠眼球取血測定血尿酸濃度，取關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行病理檢查，并取胃和小腸進(jìn)行大體損傷評價：以胃粘膜為例，取出胃后沿胃大彎剪開胃壁、使胃腔粘膜外翻，生理鹽水漂洗3遍后,以游標(biāo)卡尺測定潰瘍指數(shù),按Guth標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)記分。7、將記錄的數(shù)據(jù)填入下表，并進(jìn)行統(tǒng)計分析表1各組大鼠的兩下肢最大徑差值平均值的變化組別1d2d3d4d5d6d7d空白對照組模型對照組西尼地平組吲哚美辛組聯(lián)合用藥組表2各組大鼠的步態(tài)評分平均值的變化組別1d2d3d4d5d6d7d空白對照組模型對照組西尼地平組吲哚美辛組聯(lián)合用藥組表3不同治療方案對各組大鼠血尿酸、關(guān)節(jié)滑膜、胃腸道的影響組別血尿酸濃度滑膜檢查結(jié)果胃腸道損傷評價組別4d8d4d8d胃小腸空白對照組模型對照組西尼地平組吲哚美辛組聯(lián)合用藥組【預(yù)期實驗結(jié)果】1、整個實驗期間,空白組大鼠毛發(fā)光澤,雙目有神,反應(yīng)敏捷,進(jìn)食正常。而給予次黃嘌呤灌胃加冰敷誘導(dǎo)的大鼠從第3d開始出現(xiàn)顯著的右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹，與空白對照組比較，其兩下肢最大徑差值的增大、步態(tài)評分的上升以及4d時高于正常大鼠的血尿酸濃度均有統(tǒng)計學(xué)意義，并且關(guān)節(jié)滑膜組織可見大量炎細(xì)胞浸潤及纖維蛋白滲出，伴充血、水腫、滑膜細(xì)胞及血管增生，有不同程度的變性、壞死，說明本實驗中高尿酸血癥與低溫誘發(fā)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型制備成功。2、開始給藥治療后，模型對照組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度、步態(tài)評分、血尿酸濃度與滑膜病變程度可呈一定的上升趨勢；西尼地平組大鼠血壓下降，血尿酸濃度上升幅度明顯小于模型組、甚至略有下降，且其關(guān)節(jié)腫脹程度、步態(tài)評分、滑膜病變程度略低于模型組（差異有統(tǒng)計學(xué)意義）；吲哚美辛組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度、步態(tài)評分、滑膜病變程度顯著下降，但無降低血尿酸濃度作用，且進(jìn)行胃腸道損傷檢查可見胃腸粘膜有較多的潰瘍（差異有統(tǒng)計學(xué)意義）；聯(lián)合用藥組大鼠既可見關(guān)節(jié)腫脹程度、步態(tài)評分、滑膜病變程度顯著減輕，又有血尿濃度的下降，并且胃腸道潰瘍指數(shù)顯著低于吲哚美辛單用組，同時有血壓下降（差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。 上述結(jié)果說明：西尼地平可通過降低血尿酸濃度來治療痛風(fēng)，而西尼地平與吲哚美辛合用時，可在增加痛風(fēng)治療效果的同時減少吲哚美辛引起的消化性潰瘍等不良反應(yīng)，對于臨床上急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療具有一定的意義，且尤其適用于伴有原發(fā)或繼發(fā)性高血壓的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病人?！咀⒁馐马棥?.給大鼠灌胃時保持大鼠口腔和食管成一直線，以免灌胃針刺破食管或誤入氣管。2.冰敷時保持大鼠右下肢伸直微曲，將含冰水混合物的小氣球用紗布包裹放置于右下肢膝關(guān)節(jié)正上方，接觸面覆蓋膝關(guān)節(jié)正面和左右兩側(cè)。每半小時更換一次，保持低溫?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1].陳灝珠.實用內(nèi)科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:2602[2].ChouCT，LaiJS．TheepidemiologyofhyperuricemiaandgoutinTaiwanaborigines［J］．BrJRheumatol，1998，37(3):258－262．[3].薛耀明.痛風(fēng)的診斷與治療[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2004:21-22[4].WortmannRL.Recentadvancesinthemanagementofgoutan-hype-ruricemia[J].CurrOpinRheumato,l2005,17(3):319-24.[5].Perez-RuizF,HernandoI,VillarI,eta.lCorrectionofallopurinoldosingshouldbebasedonclearanceofcreatinine,butnotplasmacreatininelevels.Anotherinsighttoallopurino-lrelatedtoxicity[J].ClinRheumato,l2005,11(3):129-33.[6].張照偉，傅繼華．痛風(fēng)的藥物治療新進(jìn)展［J］．安徽醫(yī)藥，2011，15(4):408-410．[7].LiuCY,Sims-McCallumRP,SchifferCA.Asingledoseofras-buricaseissufficientforthetreatmentofhyperuricemiainpatientsreceivingchemotherapy[J].LeukemiaResearch,2005,29(4):463-5.[8].NielE,ScherrmannJM.Colchicinetoday[J].JointBoneSpine,2006,73(6):672-8.[9].李俊.解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥.見：楊寶峰.藥理學(xué).第8版.人民衛(wèi)生出版社，2013.170[10].MIZUTAE,HAMADAT,IGAWAO,etal.Calciumant-agonist:currentandfutureapplicationsbasedonnewevidence.Themechan