3.2.3基因工程的基本操作程序（DNA凝膠電泳基因表達載體的構(gòu)建）高二下學期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程基因工程的基本操作程序（DNA凝膠電泳+基因表達載體的構(gòu)建）移液離心反應制備凝膠加樣電泳①②③④基因表達載體≠載體導學核心步驟導學P80第一段P80第二段目的P84第一段P84第二段P85注意1-4打勾思1.【P84第一段】PCR利用了DNA的熱變性原理2.DNA向著與其所帶電荷相同的電極移動3．加樣時，將PCR產(chǎn)物注入靠近陰極的加樣孔內(nèi)4.帶有負電荷的核酸需要加在電泳槽的負極5.DNA片段根據(jù)長度大小在凝膠上分開，形成連續(xù)的條帶6.切斷電源后即可用肉眼觀察到DNA條帶在凝膠上的位置7.P84表格:PCR反應體系中的擴增緩沖液中含有、4種脫氧核糖核苷酸等成分8．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進行高壓滅菌處理9．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換10.【P85注意2】PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化11.進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應分裝成小份，并在20℃儲存12．【P85步驟7】電泳時，電泳緩沖液不能沒過凝膠以免凝膠加樣孔中的電泳樣液流出13．在提取白色絲狀物時雙向攪拌比單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNA14.【P85步驟4、8、9】上(載)樣緩沖液中的電泳指示劑可使核酸顯色15.【P85步驟8】瓊脂糖凝膠電泳中的緩沖液中含指示劑，其可以在紫外燈下被檢測出來16．瓊脂糖凝膠中的DNA分子和擴增的引物被核酸染料染色后，可在紫外燈下檢測出來17.基因表達載體中的胰島素可通過人肝細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得18．表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原（起）點19．一種雙鏈DNA分子被三種不同的限制酶切割，切割產(chǎn)物通過電泳分離，電泳結(jié)果如圖

①呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)

②分子質(zhì)量大小為10kb

③有一個NotI和兩個EcoRI切點

④其NotI切點與EcoRI切點的最短距離為2kb議自由展1.【P84第一段】PCR利用了DNA的熱變性原理

√2.DNA向著與其所帶電荷相同的電極移動

×相反3．加樣時，將PCR產(chǎn)物注入靠近陰極的加樣孔內(nèi)

×

DNA分子可帶正電荷或負電荷，加樣時不一定靠近陰極4.帶有負電荷的核酸需要加在電泳槽的負極

對

加在負極，向正極遷移5.DNA片段根據(jù)長度大小在凝膠上分開，形成連續(xù)的條帶×

不連續(xù)6.切斷電源后即可用肉眼觀察到DNA條帶在凝膠上的位置

錯

紫外燈下觀察照相7.P84表格:PCR反應體系中的擴增緩沖液中含有4種脫氧核糖核苷酸等成分

錯8.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進行高壓滅菌處理

×移液器不需滅菌處理9.在向微量離心管中添加反應組分時,每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換

對10.【P85注意2】PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化

×

緩慢11.DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需緩沖液和酶應分裝成小份,在20℃儲存

錯-20℃12．電泳時，電泳緩沖液不能沒過凝膠以免凝膠加樣孔中的電泳樣液流出

×

沒過1mm13.提取白色絲狀物時雙向攪拌比單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNA

×單向更有利于展114.【P85步驟4、8、9】上(載)樣緩沖液中的電泳指示劑可使核酸顯色

×

核酸顯色:核酸染料，不是電泳指示劑

15.【P85步驟8】瓊脂糖凝膠電泳中的緩沖液中含指示劑,其可以在紫外燈下被檢測出來

×瓊脂糖里加核酸染料(顯色),不加指示劑16．瓊脂糖凝膠中的DNA分子和擴增的引物被核酸染料染色后,可在紫外燈下檢測出來

×擴增的產(chǎn)物

17.基因表達載體中的胰島素可通過人肝細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得

錯

基因選擇性表達

不在人肝細胞中表達18．表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原(起)點×

表達啟動于啟動子展219．一種雙鏈DNA分子被三種不同的限制酶切割，切割產(chǎn)物通過電泳分離，電泳結(jié)果如左圖

①呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)

√

②分子質(zhì)量大小為10kb

√

③有一個NotI和兩個EcoRI切點√

④其NotI切點與EcoRI切點最短距離為2kb

×1Kb20.圖甲表示某環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ）完全酶切后的片段電泳結(jié)果,若改變條件使其酶切不充分就有可能獲得如圖乙所示的電泳結(jié)果（Kb即千個堿基對）①該DNA分子全長至少為7Kb，該DNA分子中至少含有4個EcoRⅠ酶切位點

√②反應時間越長，得到圖甲結(jié)果的可能性越大

√③限制性核酸內(nèi)切酶主要來自原核生物，化學本質(zhì)都是蛋白質(zhì)

√只有核酶本質(zhì)是RNA④適當增加EcoRⅠ濃度，更可能得到圖乙的結(jié)果

×

更可能得到圖甲√展37.(1)DNA分子量越大，遷移速度越？慢

右圖電泳起始端是上端(3)條帶的寬度與①初始狀態(tài)模板DNA含量

有關？

亮度與①初始狀態(tài)模板DNA含量有關。遷移速率與②擴增產(chǎn)物大小有關？(2)圖中M是標準對照，1-3依次循環(huán)16、18、21次后的結(jié)果圖。陰性對照用①蒸餾水還是②已知長度的待測基因片段設置？陽性對照用①還是②設置？

M是否是陽性對照？(4)圖中最適宜的循環(huán)次數(shù)是多少次？18

依據(jù)是?2號條帶比1號條帶寬、亮,而3號條帶較彌散√√6.電泳結(jié)果出現(xiàn)非特異性條帶的原因可能有？①②③

【二卷】①引物特異性不強（如與非目的序列有同源性）②模板DNA被污染③退火溫度過低

④退火溫度過高拓:從引物的角度考慮可能的原因是引物與非目的序列有同源性3.PCR控制DNA雙鏈解聚與結(jié)合的方法是控制溫度。4.PCR產(chǎn)物的鑒定方法是

瓊脂糖凝膠電泳與DNA遷移速率有關的是:①凝膠濃度②DNA分子大?、跠NA構(gòu)象中評1（二）基因工程第二步(核心步驟)-基因表達載體的構(gòu)建1.目的:①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在；②并且可以遺傳給下一代,

③同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用2.不能直接將目的基因?qū)胧荏w細胞原因是:①目的基因無復制原點；②目的基因無表達所需啟動子3.基因表達載體包括:目的基因、啟動子、終止子、復制原點、

標記基因.啟動子作用是：RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點,驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶結(jié)合部位:在DNA上，√√DNAmRNAmRNA轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯啟動子、終止子：本質(zhì)是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段?！就?】為使目的基因表達，應將目的基因插入啟動子、終止子之間。2.甲重組質(zhì)粒中目的基因不能表達，原因是甲中目的基因插入在啟動子的上游，不能轉(zhuǎn)錄。丙重組質(zhì)粒中目的基因不能表達，原因是目的基因插入在終止子的下游,不能轉(zhuǎn)錄。評2酶切位點能否用BamHⅠ和XbaⅠ？啟動子

1.啟動子具有物種特異性eg:枯草桿菌分泌一種降解纖維素的酶,由W基因編碼。為在乳酸桿菌中表達W基因,在質(zhì)粒上加入乳酸桿菌還是枯草桿菌的啟動子？2.啟動子具有組織特異性為使藥用蛋白基因在牛乳腺細胞內(nèi)特異性表達，將目的基因插入到乳腺中特異表達的基因啟動子之后。3.插入不同外源基因時需插入不同的特異啟動子。

原因是：特定基因只能在特定器官中表達

BLG基因:乳腺細胞中特異性表達評3DNA測序常用雙脫氧核苷酸測序法,原理是:ddNTP3'碳原子都不含-OH,在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵,因此中斷DNA分子合成反應。在四個單獨的PCR反應體系中,分別額外摻入ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP,使DNA復制隨機終止,產(chǎn)生不同長度的DNA片段,然后凝膠電泳分離檢測,從而分析獲得目標DNA的堿基序列。評4目標DNA區(qū)域X的堿基序列為__5’—CTGACTT—3’檢1.基因工程的核心：基因表達載體的構(gòu)建，其目的是：①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,②并且可以遺傳

給下一代,③同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用2.基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、復制原點和終止子、標記基因.3.啟動子作用是：RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。若要使目的基因正常表達，需將目的基因插入到_啟動子和終止子_之間。4.基因表達載體構(gòu)建用到的工具有限制酶、DNA連接酶、運載體.

基因表達載體基本單位:脫氧核苷酸5.腺病毒作為載體應具備的條件是①有一至多個限制酶切割位點②有標記基因③有復制原點6.有時為了滿足應用的需要，會在載體中人工構(gòu)建誘導型啟動子，當誘導物存在時，可以？激活或抑制目的基因的表達7.PCR控制DN