《泛腫瘤異質(zhì)性血管細胞整合及鑒定指南》標準文本草案

4T/FDSAXXXX—XXXX泛腫瘤異質(zhì)性血管細胞整合及鑒定指南本文件給出了基于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)整合與識別不同功能血管相關(guān)細胞的標準化數(shù)據(jù)處理方法，包括單細胞數(shù)據(jù)整合，污染因素去除，批次矯正以及細胞亞型鑒定方法等。本文件適用于腫瘤微環(huán)境、血管生成及內(nèi)皮細胞研究的科學家和研究人員使用。本文件適合各級醫(yī)院腫瘤科、病理科等相關(guān)科室臨床醫(yī)師以及從事臨床教學、科研等工作者使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。Tumorvasculatureatsingle-cellresolutionUnderstandingtumourendothelialcellheterogeneityandfunctionfromsingle-cellomics3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1單細胞轉(zhuǎn)錄組測序single-cellRNAsequencing;scRNA-seq單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是一種測序技術(shù)，用于捕獲和定量分析單個細胞的mRNA分子。這種技術(shù)允許研究人員在單細胞水平上研究基因表達，從而提供了對細胞間異質(zhì)性、細胞發(fā)育軌跡和細胞間相互作用的深入理解。3.2內(nèi)皮細胞endothelialcells；ECs內(nèi)皮細胞是覆蓋血管內(nèi)表面的一層扁平細胞，形成了血管壁的內(nèi)襯。這些細胞在動脈、靜脈、毛細血管以及淋巴管中均有分布，構(gòu)成了血管內(nèi)皮。3.3血管內(nèi)皮細胞vascularendothelialcells；VECs血管內(nèi)皮細胞是位于血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞，負責調(diào)節(jié)血管的通透性、血液流動以及血管的收縮和擴張。血管內(nèi)皮細胞在維持血管完整性和功能中起關(guān)鍵作用，參與血管生成、炎癥反應(yīng)和血管舒張等過程。5T/FDSAXXXX—XXXX3.4動脈內(nèi)皮細胞arterialendothelialcells；ArtECs動脈內(nèi)皮細胞是指覆蓋在動脈血管內(nèi)壁的單層扁平細胞，屬于內(nèi)皮細胞的一種。它們在維持血管功能和結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。3.5靜脈內(nèi)皮細胞venousendothelialcells；VenECs靜脈內(nèi)皮細胞是覆蓋在靜脈血管內(nèi)壁的單層扁平細胞，屬于內(nèi)皮細胞的一種。它們在調(diào)節(jié)血液回流、維持血管通透性和血管生物學功能方面起重要作用。3.6毛細血管內(nèi)皮細胞capillaryendothelialcells；CapECs毛細血管內(nèi)皮細胞是指覆蓋在毛細血管內(nèi)壁的單層細胞。這些細胞在微循環(huán)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，負責調(diào)節(jié)血液與組織之間的物質(zhì)交換。3.7淋巴管內(nèi)皮細胞lymphaticendothelialcells；LECs淋巴管內(nèi)皮細胞是覆蓋在淋巴管內(nèi)壁的細胞，屬于內(nèi)皮細胞的一種。它們在調(diào)節(jié)淋巴液流動、免疫監(jiān)視和維持組織液平衡方面起重要作用。3.8壁細胞muralcell；MCs壁細胞是一類存在于血管壁和微血管壁的支持細胞，包括平滑肌細胞和周細胞。它們在維持血管的結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用。3.9周細胞pericytes；PCs周細胞是一種位于毛細血管和小靜脈周圍的間質(zhì)細胞，嵌入在內(nèi)皮細胞基底膜內(nèi)。它們的主要特征是具有突起狀結(jié)構(gòu)，可以延伸到血管壁上，與內(nèi)皮細胞形成物理和功能上的聯(lián)系。3.10平滑肌細胞smoothmusclecells；SMCs平滑肌細胞是內(nèi)臟器官中的關(guān)鍵細胞，負責調(diào)節(jié)管腔和空腔器官的收縮和舒張。它們的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)節(jié)機制使其在維持內(nèi)臟器官的正常功能中扮演著重要角色。3.11血管生成angiogenesis血管生成是指從現(xiàn)有血管中生成新血管的生物學過程。這個過程在許多生理和病理情況下都非常重要，包括胚胎發(fā)育、傷口愈合、月經(jīng)周期以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等。6T/FDSAXXXX—XXXX4泛腫瘤單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)收集與整理為了使本標準更加全面與適用，前期收集了涵蓋31種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，包括372名患者和437個樣本。經(jīng)過數(shù)據(jù)處理和細胞注釋過程，本標準最終收錄了183,977個血管細胞（見表1）。這些scRNA-seq數(shù)據(jù)主要涉及7種技術(shù)平臺：10xGenomicsChromium、BDRhapsody、DropSeq、Microwell-seq、SeekOneDDChip、Seq-well和Singleron。對于可獲得原始scRNA-seq數(shù)據(jù)集，我們量化了基因表達計數(shù)矩陣；否則，我們下載了CPM/TPM矩陣并用于下游分析?？偣灿兴姆N技術(shù)生成的數(shù)據(jù)集需要從原始數(shù)據(jù)開始處理，包括10xGenomicsChromium、BDRhapsody、Singleron和SeekOneDDChip。4.1原始數(shù)據(jù)處理10xGenomicsChromium平臺：FASTQ文件使用CellRangertoolkit（v.6.1.2）進行比對和定量分析，初步過濾后的UMI矩陣由CellRanger流程生成，并用于下游分析。BDRhapsody平臺：FASTQ文件通過BDRhapsody?分析流程（BDBiosciences）進行處理，并在CWL-runner中實現(xiàn)。唯一分子標識符（UniqueMolecularIndentifier，UMI）計數(shù)使用BDBiosciences開發(fā)的遞歸替換誤差校正（recursivesubstitutionerrorcorrection，RSEC）算法進行校正，以糾正測序和PCR錯誤。條形碼寡核苷酸結(jié)合抗體（單細胞多重試劑盒；BDBiosciences）用于通過BDRhapsody分析流程推斷樣本來源。Singleron平臺：使用SCOPE-tools將FASTQ測序數(shù)據(jù)映射到人類基因組。首先，對讀段1進行過濾并提取細胞條形碼和UMI，將其添加到讀段2的ID中。然后，利用cutadapt對讀段2進行修剪。接著，使用STAR將修剪后的讀段2比對到參考基因組上。使用featureCounts將已比對的讀數(shù)定位到基因的基因組位置。最后，合并具有相同細胞條形碼、UMI和基因的讀數(shù)，得到每個細胞每個基因的UMI數(shù)量。SeekOneDDChip平臺：使用SeekOneTools（BeijingSeekGeneBioSciences）處理FASTQ原始數(shù)據(jù)，處理過程與CellRanger流程相似，最終輸出每個細胞在不同基因上的UMI值。注：所有讀段都比對到GRCh38版本的參考基因組中（ensembleversion99）。4.2質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)過濾首先，我們對每個單細胞數(shù)據(jù)集應(yīng)用Seurat管道20，根據(jù)細胞內(nèi)表達的基因數(shù)目、UMI數(shù)目，對細胞進行過濾20。然后，我們使用CellCycleScoring函數(shù)計算線粒體和核糖體UMI計數(shù)的百分比，以及S期和G2M期的評分。接著，我們過濾掉線粒體UMI計數(shù)超過30%的細胞，并使用Scrublet的默認參數(shù)去除潛在的雙細胞21。4.3主要細胞亞群注釋與血管細胞提取FindVariableFeatures函數(shù)使用“vst”方法識別前2,000個高變異基因。隨后，使用SCTransform函數(shù)對高變異基因表達矩陣進行標準化，應(yīng)用回歸方法去除線粒體和核糖體基因百分比、細胞周期和供體的影響。7T/FDSAXXXX—XXXX接著，使用RunPCA函數(shù)進行主成分分析，然后用R包harmony中的RunHarmony函數(shù)對前30個主成分進行技術(shù)和樣本效應(yīng)校正22。通過FindNeighbors函數(shù)構(gòu)建SNN圖，并使用基于“harmonyreduction”的FindClusters函數(shù)中的“Louvain算法”對細胞進行聚類。對于所有數(shù)據(jù)集，分辨率參數(shù)設(shè)置為2.0，以產(chǎn)生足夠細化的聚類23。接下來，根據(jù)經(jīng)典標記物的表達對血管細胞群進行注釋，內(nèi)皮細胞（endothelialcells，ECs）使用PECAM1，壁細胞（muralcell，MCs，包括平滑肌細胞/周細胞）使用RGS5、PDGFRB、ACTA2和TAGLN。然后，我們使用FindAllMarkers函數(shù)識別每個血管群中的差異表達基因。發(fā)現(xiàn)某些群高表達編碼熱休克蛋白的基因，可能與先前描述的組織解離操作有關(guān)23-25。我們統(tǒng)計了在解離相關(guān)群中復發(fā)率超過30%的標記基因，將其定義為解離誘導基因，并進一步使用AddModuleScore函數(shù)計算解離誘導基因評分。此外，識別出一些污染群，顯示出黑素細胞（PMEL、MLANA和TYRP1）、上皮細胞（EPCAM）、紅細胞（HBB、HBA1和HBA2）、髓系細胞（CD163、CD14和LYZ）、T/NK細胞（CD2、CD3D、PTPRC和KLRD1）以及B/漿細胞（CD79A和MS4A1）的特征。這些與解離相關(guān)和污染的群被排除在后續(xù)分析之外。表1.泛腫瘤單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計AM996833562355227812378T/FDSAXXXX—XXXX9336648115血管細胞整合與主要細胞群體鑒定5.1細胞和基因篩選首先，整合由多個平臺生成的異質(zhì)性血管細胞。篩選過程中，去除了在少于100個細胞中表達的基因，以及表達少于200個基因或多于4000個基因的細胞。5.2基因表達矩陣標準化對整合后的基因表達矩陣進行標準化處理，檢測出前2000個高變異基因。為減少線粒體基因和核糖體基因百分比、細胞周期、解離誘導基因特征、技術(shù)和供體的影響，使用ScaleData函數(shù)對高變異基因計數(shù)矩陣進行Z-score標準化。5.3批次效應(yīng)消除為消除批次效應(yīng)，利用R包simspec中的cluster_sim_spectrum函數(shù)計算聚類相似譜（ClusterSimilaritySpectrum，CSS）26，并采用默認參數(shù)。具體步驟如下：i.將每個供體的細胞進行分組，基于預(yù)先計算的前20個主成分應(yīng)用Louvain聚類，分辨率設(shè)置為0.6。ii.計算每個供體中每個聚類的高變異基因平均表達量。iii.計算每個供體中細胞和聚類之間的Spearman相關(guān)系數(shù)。iv.對于每個細胞，將其與不同供體中不同聚類的相關(guān)性進行Z-score轉(zhuǎn)換，這些相關(guān)性被連接起來，形成了最終的CSS維度27,28。v.在CSS維度上執(zhí)行UMAP可視化。5.4血管相關(guān)細胞的主要群落注釋根據(jù)經(jīng)典基因表達，ECs被注釋為淋巴管內(nèi)皮細胞（lymphaticendothelialcells，LECs）和血管內(nèi)皮細胞（vascularendothelialcells，VECs），其中血管內(nèi)皮細胞包括動脈內(nèi)皮細胞（arterialendothelialcells，9T/FDSAXXXX—XXXXArtECs）、靜脈內(nèi)皮細胞（venousendothelialcells，VenECs）和毛細血管內(nèi)皮細胞（capillaryendothelialcells，CapECs）。此外，我們檢測到正在經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymaltransition，EndoMT）的VECs，這些細胞共表達內(nèi)皮和間充質(zhì)標記物。此外，在相應(yīng)的癌旁組織中，還鑒定出兩種特定組織的內(nèi)皮細胞，包括腎小球細胞（renalglomerularcells，RGCs）和肝竇內(nèi)皮細胞（liversinusoidalECs，LSECs表2，圖1）。表2.血管相關(guān)細胞標記基因圖1.泛腫瘤血管相關(guān)單細胞圖譜。(a)血管相關(guān)細胞的UMAP降維可視化結(jié)果，不同細胞類型使用不同的顏色進行了標注。(b)熱圖展示了不同血管相關(guān)細胞的經(jīng)典基因表達水平。5.5整合效果量化通過計算局部逆辛普森指數(shù)（LocalInverseSimpson’sIndex，LISI）來量化整合效果，使用R包LISI中的compute_lisi函數(shù)（/immunogenomics/LISI）。該指標反映了細胞鄰域中數(shù)據(jù)集的有效數(shù)量。較高的LISI值表示鄰域中由更多的數(shù)據(jù)集提供，從而降低批次效應(yīng)。經(jīng)過不同的處理過程，可以觀察到LISI水平逐步提高，這表明數(shù)據(jù)整合效果良好（圖2）。T/FDSAXXXX—XXXX圖2.血管細胞的數(shù)據(jù)整合。(a)UMAP圖展示了整合步驟后血管細胞的分布（從原始計數(shù)到Z-score標準化再到CSS）。經(jīng)過CSS處理后，不同平臺生成的細胞明顯聚類。(b)UMAP圖展示了各細胞類型的選定標記基因表達。(c)箱線圖展示了每個整合步驟后的LISI值（n=116,958個細胞）。對于箱線圖，中心線表示中位數(shù)，箱體范圍表示上四分位數(shù)和下四分位數(shù)，須線延伸至1.5倍四分位距。6血管細胞鑒定魯棒性分析在本研究中，我們對血管細胞鑒定和整合的魯棒性進行了多方面的詳細分析。以下是主要分析點：6.1數(shù)據(jù)整合方法選擇T/FDSAXXXX—XXXX我們采用了CSS算法進行數(shù)據(jù)整合，而非廣泛使用的Harmony方法。Harmony因可能導致過度矯正而著稱，從而可能掩蓋生物學上真實存在的差異。CSS通過不同樣本中細胞聚類的相似性來表征每個細胞，生成無監(jiān)督的無參考數(shù)據(jù)表示。6.2批次矯正性能比較我們對CSS與BBKNN和Harmony等已知方法的批次矯正性能進行了詳細比較（圖3a）。觀察到使用不同批次矯正方法后，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT-ECs）細胞類型的分布明顯不同（圖3b）。在我們的研究中，EndoMT-ECs被注釋為兩種類型：PDGFRB+的EndoMT-I和DCN+的EndoMT-II（圖3c）。6.3LISI分析通過計算局部LISI，進一步量化了不同方法的單細胞整合效果（圖3d）。結(jié)果表明，CSS在整合單細胞數(shù)據(jù)時，相較于BBKNN和Harmony是一種相對溫和的方法，能夠更好地減少批次效應(yīng)而不過度矯正。6.4血管細胞獨立聚類現(xiàn)象分析獨特屬性和內(nèi)皮細胞異質(zhì)性：除了ArtECs，VenECs，CapECs外，還有一些特定器官的EC群體，如維持肝星狀細胞在靜止狀態(tài)的LSECs，從而抑制肝內(nèi)血管收縮和纖維化的發(fā)展29；以及具有獨特窗孔特征的RGCs，能夠處理大量的過濾30。因此，考慮到這些細胞的獨特屬性和內(nèi)皮細胞的異質(zhì)性，數(shù)據(jù)整合后獨立的LSECs和RGCs群體可以作為潛在批次效應(yīng)被校正的指示。數(shù)據(jù)來源和樣本組成分析：我們分析了LSECs和RGCs的數(shù)據(jù)來源、樣本組成和樣本類型（圖3d）。LSECs主要來源于多份樣本的相鄰非腫瘤組織，這些樣本來自兩個已發(fā)表的數(shù)據(jù)集：Lu等人的肝癌研究31和Zhang等人的肝內(nèi)膽管癌研究32。RGCs主要來自一個樣本的相鄰非腫瘤組織（GSM4735369，83%）。此外，GSM4735369僅貢獻了我們的圖譜中的RGCs（圖3f）。因此，我們可以認為這是一個樣本特定的RGCs群體。獨立數(shù)據(jù)集驗證：為了進一步確認這兩個細胞群體的身份，我們進行了獨立的數(shù)據(jù)整合測試。我們使用了兩個單細胞數(shù)據(jù)集，每個數(shù)據(jù)集都有預(yù)定義的肝臟和腎臟組織的細胞類型。一個數(shù)據(jù)集用于LSECs（來自MacParland等人）33，另一個用于RGCs（來自Zhang等人）34。結(jié)果顯示，新加入的細胞能夠與我們的LSECs和RGCs聚合（圖3g）。此LSEC:CLEC4G和CLEC1C）在我們的LSECs和RGCs中高度表達，進一步支持了我們定義的細胞身份。綜上所述，通過采用CSS算法和多種分析方法，我們確保了血管細胞鑒定的魯棒性，減小了批次效應(yīng)的影響，同時保留了生物學上的重要差異，為泛腫瘤異質(zhì)性血管細胞的整合和研究提供了堅實的基礎(chǔ)。T/FDSAXXXX—XXXX圖3.數(shù)據(jù)整合和批次效應(yīng)矯正分析。(a)不同方法的UMAP圖，展示了CSS、BBKNN和Harmony的整合效果。(b)不同批次矯正方法下的EndoMT-ECs分布比較。(c)PDGFRB+的EndoMT-I和DCN+的EndoMT-II的UMAP圖。(d)使用不同方法計算的LISI值比較。(e)LSECs和RGCs的數(shù)據(jù)來源、樣本組成和樣本類型分析。(f)GSM4735369在RGCs群體中的貢獻。(g)獨立數(shù)據(jù)集的整合驗證，展示了LSECs和RGCs的融合情況。(h)LSECs和RGCs相關(guān)細胞標志物的表達水平(RGCs:EMCN,SOST和PLAT;LSECs:CLEC4G和CLEC1C)。7小結(jié)及展望在本指南中，我們詳細闡述了基于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，整合和鑒定泛腫瘤異質(zhì)性血管細胞的方法和流程。通過對183,977個血管細胞的分析，我們成功識別并分類了多種內(nèi)皮細胞和壁細胞，揭示了腫瘤微環(huán)境中血管細胞的復雜性和多樣性。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于深入理解內(nèi)皮細胞在腫瘤進展和抗血管生成療法中的關(guān)鍵角色，還為未來的抗血管生成治療提供了新的思路和潛在靶點。隨著單細胞技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法的不斷進步，我們可以期待更高分辨率和更大規(guī)模的數(shù)據(jù)整合與分析，從而更全面地揭示血管細胞的異質(zhì)性和功能特性。此外，結(jié)合多組學數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，我們將能夠更加精準地描繪血管細胞在腫瘤微環(huán)境中的動態(tài)變化和相互作用。這將進一步推動精準醫(yī)療和個性T/FDSAXXXX—XXXX化治療的發(fā)展，為臨床應(yīng)用提供更加堅實的理論基礎(chǔ)。我們相信，這些研究成果將促進抗血管生成療法的優(yōu)化和創(chuàng)新，提高其在不同腫瘤類型和患者中的療效，最終為癌癥治療帶來新的突破。1Zeng,Q.etal.Understandingtumourendothelialcellheterogeneityandfunctionfromsingle-cellomics.NatRevCancer23,544-564(2023)./10.1038/s41568-023-00591-52Potente,M.,Gerhardt,H.&Carmeliet,P.Basicandtherapeuticaspectsofangiogenesis.Cell146,873-887(2011)./10.1016/j.cell.2011.08.0393Eelen,G.,Treps,L.,Li,X.&Carmeliet,P.BasicandTherapeuticAspectsofAngiogenesisUpdated.CircRes127,310-329(2020)./10.1161/CIRCRESAHA.120.3168514Pober,J.S.&Sessa,W.C.Evolvingfunctionsofendothelialcellsininflammation.NatRevImmunol7,803-815(2007)./10.1038/nri21715Potente,M.&Makinen,T.Vascularheterogeneityandspecializationindevelopmentanddisease.NatRevMolCellBiol18,477-494(2017)./10.1038/nrm.2017.366Bergers,G.&Song,S.Theroleofpericytesinblood-vesselformationandmaintenance.NeuroOncol7,452-464(2005)./10.1215/S11528517050002327Bennett,M.R.,Sinha,S.&Owens,G.K.VascularSmoothMuscleCellsinAtherosclerosis.CircRes118,692-702(2016)./10.1161/CIRCRESAHA.115.3063618Hanahan,D.HallmarksofCancer:NewDimensions.CancerDiscov12,31-46(2022)./10.1158/2159-8290.CD-21-10599Jayson,G.C.,Kerbel,R.,Ellis,L.M.&Harris,A.L.Antiangiogenictherapyinoncology:currentstatusandfuturedirections.Lancet388,518-529(2016)./10.1016/S0140-6736(15)01088-010Garcia,J.etal.Bevacizumab(Avastin(R))incancertreatment:Areviewof15yearsofclini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