切向流過濾完整版本

CompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)鹽析，等電點沉淀透析，超濾凝膠過濾層析離子交換層析親和層析密度梯度離心CompanyLogo

常用中性鹽：硫酸銨，硫酸鈉，氯化鈉CompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)鹽析，等電點沉淀透析，超濾凝膠過濾層析離子交換層析親和層析密度梯度離心CompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogo切向流過濾

切向流過濾（TangentialFlowFiltration，簡稱TFF）其概念是相對于常規(guī)過濾（NormalFlowFiltration，簡稱NFF）而言的。

切向流過濾則是指液體的流動方向是平行于膜表面的，在壓力的作用下只有一部分的液體穿過濾膜進入下游，這種操作方式也有人稱之為“錯流過濾”（CrossFlowFiltration）。蛋白質(zhì)純化技術(shù)蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogo

切向流過濾蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogo切向流工藝優(yōu)化參數(shù)

切向流流量

跨膜壓（TMP）

透出液控制

膜面積

透析條件

蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogoCompanyLogo

具有透過液控制的切向流過濾系統(tǒng)示意圖蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)鹽析，等電點沉淀透析凝膠過濾層析離子交換層析親和層析高壓液相層析密度梯度離心CompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)CompanyLogoCompanyLogo蛋白質(zhì)純化技術(shù)鹽析，等電點沉淀透析凝膠過濾層析離子交換層析親和層析密度梯度離心CompanyLogo層析技術(shù)

層析分離又稱色譜分離（ChromatographicResolution,CR）或色層分離。

根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相（固定相和流動相）中。

在固定相和流動相之間經(jīng)過多次分配以不同的速率移動，從而達到分離的目的。蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo蛋白質(zhì)層析技術(shù)層析技術(shù)基本原理

1.吸附層析

混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物得到分離。2.分配層析

其固定相和流動相都是液體，其原理類似于液液萃取，利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。

3.凝膠過濾層析

由于大分子和小分子在通過色譜柱時，所通過得路徑不同（大分子進入空隙，小分子進入孔內(nèi)），流出色譜柱的時間不同，從而得到分離。CompanyLogo蛋白質(zhì)層析技術(shù)層析技術(shù)分類

1.按分離機理不同分類

吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析2.按固定相形狀不同分類

柱層析、紙層析、薄層層析3.根據(jù)流動相的物理形態(tài)不同分類

氣相層析、液相層析、超臨界層析4.根據(jù)層析分離的規(guī)模大小分類

分析型（一次進樣量<10mg）、半制備型（一次進樣量10-50mg）、制備型（一次進樣量0.1-10g）和工業(yè)生產(chǎn)型（>20g/d）CompanyLogo凝膠過濾層析（gelchromatography）又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠層析、凝膠滲透層析等。

利用凝膠過濾介質(zhì)為固定相，根據(jù)物料中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差異的液相色譜法。蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogoCompanyLogo凝膠特性參數(shù)

排阻極限(exclusionlimit)

分級范圍(Fractionationrange)

Sepharose6FastFlow，它的分級范圍為10KD-4000KD

吸水量(Waterregains)

凝膠粒徑

Sepharose6FastFlow，它的顆粒大小為45-165um

床體積(Bedvolume)

空隙體積(Voidvolume)蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo蛋白質(zhì)層析技術(shù)凝膠介質(zhì)的種類

按基質(zhì)組成主要可以分為：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及由兩種物質(zhì)混合形成的如瓊脂糖-葡聚糖混合凝膠、聚丙烯酰胺-葡聚糖混合凝膠等。

按凝膠過濾層析能達到的柱效和分辨率又可分為：

標(biāo)準(zhǔn)凝膠介質(zhì)：顆粒尺寸較大（一般為100~250μm），機械強度相對較低高效凝膠介質(zhì)：顆粒尺寸小（一般為5~50μm），機械強度相對較高，柱效明顯提高，適合于高分辨率或更快的分離。

CompanyLogo瓊脂糖凝膠由β-D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖兩種單糖交替連接而成。

其商品名有三種①Sehparose②SepharoseCL③Superose蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogoSepharose

由于沒有交聯(lián)劑的存在，決定凝膠顆粒網(wǎng)孔大小的因素是形成凝膠時瓊脂糖的含量。分離范圍顆粒大小特性/應(yīng)用

Sepharose2BSepharose4BSepharose6BCompanyLogoSepharoseFastFlowSepharose6FastFlowSepharose4FastFlow分離顆粒范圍大小特性/應(yīng)用pH穩(wěn)定性耐壓最高流速

（Mpa）(cm/h)

蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogoSepharoseCL

SepharoseCL系列凝膠在顆粒直徑、分級范圍方面與Sepharose系列完全相同在pH穩(wěn)定范圍、機械強度（流速）及溫度穩(wěn)定性等方面得到了很大的改進Superose具有很好的機械穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，適合于高速分離過程。蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo復(fù)合結(jié)構(gòu)凝膠

SephacrylHR系列凝膠：是由烯丙基葡聚糖通過N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。Superdex系列凝膠：是將葡聚糖與高交聯(lián)度的瓊脂糖顆粒共價結(jié)合而形成的。2334cross-linkedagarosedextrancross-sectionfromSuperdex?particle蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogoCompanyLogo凝膠過濾層析的操作過程1.裝柱2.平衡（equilibrium)3.上樣(loading)4.洗脫(elution)5.凝膠再生和保養(yǎng)蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo凝膠過濾層析的影響因素1.凝膠介質(zhì)的選擇

一般排阻極限應(yīng)大于目標(biāo)分子，而分級范圍應(yīng)當(dāng)涵蓋目標(biāo)分子的大小。2.層析柱的選擇如用凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)，層析柱的長度通常為內(nèi)徑的25~40倍。3.上樣量分析型為1-2%床體積，制備型為5-30%床體積。對于蛋白質(zhì)的分級分離，上樣量通常為柱體積的2%~5%。4.洗脫流速蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo離子交換層析（IonExchangeChromatography)

以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力（靜電作用力）的差別而進行分離的一種層析方法。蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo蛋白質(zhì)層析技術(shù)載體官能團可交換離子CompanyLogo蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo離子交換劑種類

強陽離子（酸）交換劑（-SO3H）

陽離子交換劑弱陽離子（酸）交換劑（-COOH）強陰離子（堿）交換劑（-N(CH3)3）陰離子交換劑弱陰離子（堿）交換劑（-NH2）離子交換劑的基質(zhì)

疏水性樹脂---聚苯乙烯樹脂親水性聚合物---纖維素(Cellulose)球狀纖維素(Sephacel)葡聚糖

(Sephadex)瓊脂糖(Sepharose)

蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo根據(jù)目的蛋白的pI選擇合適的緩沖液pHpH=pI時，蛋白質(zhì)表面電荷為零；pH<pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷；pH>pI時，蛋白質(zhì)帶負電荷。蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogo親和層析蛋白質(zhì)層析技術(shù)目標(biāo)物CompanyLogo親和層析載體

瓊脂糖，聚丙烯酰胺，硅膠親和層析配體

酶-底物類似物，抗體抗原，過渡金屬離子等親和層析載體與配體的鏈接需要進行化學(xué)反應(yīng)使載體上化學(xué)集團處于活化狀態(tài)連接臂

增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子有效的親和結(jié)合。蛋白質(zhì)層析技術(shù)CompanyLogoThankYou!CompanyLogoCompanyLogo

2.凝膠介質(zhì)的種類

小結(jié)凝膠過濾介質(zhì)（1）葡聚糖凝膠（SephadexG-數(shù)字）（2）瓊脂糖凝膠（3）復(fù)合結(jié)構(gòu)凝膠（＊數(shù)字越小，表示介質(zhì)交聯(lián)度越大，分級范圍越小。）

①Sepharose（2B,4B,6B）②SepharoseCL（2B,4B,6B）③Superose(6,12