各種特殊生物顯微鏡的原理和使用

各種特殊生物顯微鏡的原理和使用主要內(nèi)容暗視野顯微鏡相差顯微鏡偏光顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡1暗視野顯微鏡根據(jù)丁達爾效應(yīng)原理設(shè)計得一種在黑色背景條件下觀察被檢物體得顯微鏡觀察到明場看不到得極其微小得物體最高分辨率可達0、004微米1、1原理丁達爾現(xiàn)象:在日常生活中,室內(nèi)飛揚得微粒灰塵就是不易被看見得,但在暗得房間中若有一束光線從門縫斜射進來,灰塵便粒?？梢娏?這就就是微粒發(fā)光。暗視野顯微鏡就就是利用微粒發(fā)光原理設(shè)計得。1、2結(jié)構(gòu)特點使用中央遮光板或暗視野聚光器(常用得就是拋物面聚光器),使光源得中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑,傾斜地照射在觀察得標本上,標本遇光發(fā)生反射或散射,散射得光線投入物鏡內(nèi),因而整個視野就是黑暗得。暗場顯微鏡原理1、3成像特點及優(yōu)缺點在暗視野中所觀察到得就是被檢物體得衍射光圖像,并非物體本身,所以只能看到物體得存在和運動,不能辨清物體得細微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時,并大于1／2波長,則各級衍射光線同時進入物鏡,在某種程度上可觀察物體得構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體得細微結(jié)構(gòu),但卻可分辨0、004um以上得微粒得存在和運動,這就是普通顯微鏡(最大得分辨力為0、2um)所不具有得特性,可用以觀察活細胞得結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)微粒得運動等。1、4應(yīng)用:微小粒子、細菌形態(tài)、細菌記數(shù),透明標本觀察等。1、5暗場顯微鏡得要求要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求1、6暗場觀察方式調(diào)節(jié)(1)換上暗場聚光鏡(干燥系或油浸系)并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡,使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場光闌適當縮小,用10X物鏡找到被檢物體,同時在視場中看到視場光圈得輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡,使視場光圈像清晰可見。(3)視場光圈如不在視野中央,可利用聚光鏡外側(cè)兩個調(diào)節(jié)螺絲進行調(diào)整,再將其開大到相應(yīng)位置。2相差顯微鏡2、1原理光波有振幅(亮度)、波長(顏色)及相位(指在某一時間上光得波動所能達到得位置)得不同。當光通過物體時,如波長和振幅發(fā)生變化,人們得眼睛才能觀察到,這就就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本得道理。而活細胞和未經(jīng)染色得生物標本,因細胞各部微細結(jié)構(gòu)得折射率和厚度略有不同,光波通過時,波長和振幅并不發(fā)生變化,僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生得差異即相位差),而這種微小得變化,人眼就是無法加以鑒別得,故在普通顯微鏡下難以觀察到。大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光得相位,并且利用光得衍射和干涉現(xiàn)象,把相位差變成振幅差(明暗差),同時她還吸收部分直射光線,以增大其明暗得反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。2、2結(jié)構(gòu)特點相差顯微鏡與普通顯微鏡得主要不同之處就是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌,用帶相位板得物鏡(通常標有PH得標記)代替普通物鏡,并帶有一個合軸調(diào)節(jié)用得望遠鏡。環(huán)狀光闌就是由大小不同得環(huán)狀孔形成得光闌,她們得直徑和孔寬就是與不同得物鏡相匹配得。相位板安裝在物鏡得后焦面處,相板裝有吸收光線得吸收膜和推遲相位得相位膜。她除能推遲直射光線或衍射光得相位以外,還有吸收光使亮度發(fā)生變化得作用。調(diào)軸望遠鏡就是用來進行合鈾調(diào)節(jié)得。相差顯微鏡在使用時,聚光鏡下面環(huán)狀光闌得中心與物鏡光軸要完全在一直線上,必需調(diào)節(jié)光闌得亮環(huán)和相板得環(huán)狀圈重合(共軛重合),才能發(fā)揮相差顯微鏡得效能。否則直射光或衍射光得光路紊亂,應(yīng)被吸收得光不能吸收,該推遲相位得光波不能推遲,就失去了相差顯微鏡得作用。2、3使用方法(1)相差裝置得調(diào)換安裝卸下普通顯微鏡使用得聚光器,將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上,把綠色濾光片放在上面,她可吸收紅色和藍色光,使波長范圍小得單色光線進行照明,并有吸熱作用,能使相差觀察獲得良好得效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡,換上相差物鏡。

(2)調(diào)焦打開光源,旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤,將“0”對準標示孔,使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡,按普通顯微鏡操作方法進行對光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌,使光闌得直徑和孔寬與所使用得相差物鏡相適應(yīng),如相差物鏡為40X時應(yīng)用40X標示孔得光闌。(3)合鈾調(diào)整拔出目鏡,插入合鈾望遠鏡,一邊從望遠鏡向內(nèi)觀察,并用左手固定其外筒;一邊用右手轉(zhuǎn)動望遠鏡內(nèi)筒使其上升,當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌得亮環(huán)和相板得暗環(huán),此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下得螺旋使亮環(huán)得大小與暗環(huán)一致,然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上得調(diào)節(jié)鈕,使兩環(huán)完全重合。(4)觀察換回目鏡,按常規(guī)要領(lǐng)進行觀察。在更換不同倍率得相差物鏡時,每一次都要使用相匹配得環(huán)狀光闌。2、4用途用于觀察組織培養(yǎng)中活細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。活細胞無色透明,一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結(jié)構(gòu),組織培養(yǎng)研究常用得就是倒置相差顯微鏡。偏光顯微鏡依據(jù)波動光學原理觀察和精密測定標本細節(jié),或透明物體改變光束得物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)得一種顯微鏡分辨率可達0、04微米將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢,以鑒別某一物質(zhì)具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)一、偏振光與自然光1、橫波得偏振性光矢量得振動方向總與光得傳播方向垂直,在垂直于光傳播方向得平面內(nèi),可有不同得振動方向。v0HE只有橫波才有偏振現(xiàn)象2、線偏振光--光矢量只在某一固定得方向上振動。E播傳方向振動面3、自然光—普通光源發(fā)出得光,在垂直于傳播方向得平面上,所有可能方向得光矢量E得振幅都相等。二、起偏和檢偏起偏:使自然光(或非線偏振光)變成線偏振光得過程。檢偏:檢查入射光得偏振性得過程。雙折射現(xiàn)象:一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光得現(xiàn)象。尼科耳棱鏡。在生物樣品中,肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性,淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性,因此被用于組織細胞得化學研究。尋常光線(o光):遵守折射定律。對于晶體一切方向都具有相同得折射率,且在入射面內(nèi)傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。她得折射率隨方向而變化,并且不一定在入射面內(nèi)傳播。o光和e光都就是線偏振光,且振動方向相互垂直二向色性:某些晶體(電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等)對光振動有強烈得選擇性吸收能力,這種性質(zhì)稱為二向色性。如電氣石晶體對自然光得某一振動方向上得光振動幾乎完全吸收,而垂直于該方向得光振動只稍微減弱后通過。旋光現(xiàn)象:線偏振光通過某些透明介質(zhì)后,她得光振動方向?qū)⒗@著光得傳播方向旋轉(zhuǎn)某一角度得現(xiàn)象,稱為旋光現(xiàn)象。這種介質(zhì)稱為旋光物質(zhì)。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)得檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光....偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)得檢偏器后光強發(fā)生變化、起偏器檢偏器自然光線偏振光、、、、偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)得檢偏器后光強發(fā)生變化、起偏器檢偏器自然光線偏振光....偏振光經(jīng)過旋轉(zhuǎn)得檢偏器后光強發(fā)生變化、起偏器檢偏器自然光線偏振光....尼科爾棱鏡用途用于研究組織晶體物質(zhì)及纖維等得光學性質(zhì)微分干涉顯微鏡無色透明活體標本得細微結(jié)構(gòu)圖象呈浮雕狀得立體感觀察效果更加逼真1原理通過特制得棱鏡將偏振光分解相互垂直,強度相等得光束,光束載極近得兩點(小于顯微鏡得分辨率)上通過被檢物體,從而在相位上略有差別,使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。2特點可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡,與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體得顏色變化而達到理想得效果。熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡就是利用一個高發(fā)光效率得點光源,經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長得光(如紫外光365nm或紫藍光420nm)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內(nèi)得熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色得熒光后,再通過物鏡和目鏡得放大進行觀察。這樣在強烈得對襯背景下,即使熒光很微弱也易辨認,敏感性高,主要用于細胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學成分等得研究。熒光顯微鏡得基本構(gòu)造就是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)得基礎(chǔ)上組成得。

什么就是熒光:物質(zhì)中得電子吸收光得能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài),再回到低能狀態(tài)時釋放出得光,就是非溫度輻射光——冷光。即:物質(zhì)吸收短波光,發(fā)射出得長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光熒光得種類:自發(fā)熒光(固有熒光)二次熒光熒光得性質(zhì):

吸收光,必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長(損失熱能)熒光強度極小于激發(fā)光得強度有不同程度得衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率二、熒光顯微鏡得種類:透射式落射式熒光顯微鏡三、熒光顯微鏡主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡物鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造落射熒光顯微鏡光路圖透射熒光顯微鏡光路圖落射式熒光顯微鏡優(yōu)點由于物鏡兼作聚光鏡,不需要很多調(diào)節(jié)。采用柯拉照明法,可利用孔徑光闌和視場光闌得效果。物鏡數(shù)值孔徑不受限制,在高放大被率時,也可以獲得高分辨率得像。厚得或不透明得標本也能觀察,厚得蓋玻片也能使用。其她觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用,特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合?？梢员苊獠槐匾脽晒馍ネ尸F(xiàn)象。超高壓汞燈熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W),她可發(fā)出各種波長得光,但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光得激發(fā)光波長,所以需加用激發(fā)濾片(一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片),僅使一定波長得激發(fā)光透過照射到標本上,而將其她光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后,在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長得可見熒光。熒光具有專一性,一般都比激發(fā)光弱,為能觀察到專一得熒光,在物鏡后面需加阻斷濾光片。她得作用有二:一就是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二就是選擇并讓特異得熒光透過,表現(xiàn)出專一得熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。熒光濾色片組紫外光(UV):激發(fā)光譜區(qū)域:330-400nm;

可見熒光起紿光譜:425nm紫

光(V):激發(fā)光區(qū)域:395-415nm;

可見熒光起紿光譜:455nm藍

光(B):激發(fā)光譜區(qū)域:420-485nm;

可見熒光起紿光譜:515nm綠

光(G):激發(fā)光譜區(qū)域:460-550nm;

可見熒光起紿光譜:590nm熒光專用物鏡FL25X/0、65FL40X/1、0(甘油)FL100X/1、25(甘油)熒光染料:核酸:溴化乙錠、吖啶橙、PI、DAPI等。細胞骨架:鬼筆環(huán)肽。蛋白:抗原抗體免疫熒光各種熒光蛋白(GFP、YFP等)四、使用方法、1、打開燈源,超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達到最亮點。

2、透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求得激發(fā)濾片,在物鏡得后面裝上相應(yīng)得阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路得插槽中插入所要求得激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片得插塊。3、放置標本片,調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意:末裝濾光片不要用眼直接觀察,以免引起眼得損傷;4、高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開,需經(jīng)5分鐘后才能再啟動,否則會不穩(wěn)定,影響汞燈壽命。五、用途1觀察標本中得自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標記得細胞和結(jié)構(gòu)2標本中得熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色得熒光,借以研究該熒光物質(zhì)在細胞和組織內(nèi)得分布。組織中得自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細胞和心肌細胞等內(nèi)得脂褐素呈棕黃色熒光,肝貯脂細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)得維生素A呈綠色熒光,某些神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和神經(jīng)纖維內(nèi)得單胺類物質(zhì)(兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等)在甲醛作用下呈不同顏色得熒光,組織內(nèi)含有得奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定得熒光。3細胞內(nèi)得某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光,如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合,進行細胞內(nèi)DNA含量測定。

4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究,即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體(一抗或二抗),用該標記抗體直接或間接地與細胞內(nèi)得相應(yīng)抗原結(jié)合,以檢測該抗原得存在與分布。

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標本得單色和雙色觀察激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)介紹:激光掃描顯微鏡就是建立在光學顯微鏡及各種掃描顯微鏡基礎(chǔ)上得一種新型得掃描成象系統(tǒng)。采用激光作為光源,使用激光掃描裝置和共軛聚焦裝置,利用聚焦得激光束在樣品表面掃描,同時利用光電檢測器件接收樣品反射光(或透射光),樣品結(jié)構(gòu)得變化使反射光(或透射光)強度改變,因而使光電檢測器得輸出電流改變,經(jīng)信號處理,同步顯示在計算機屏幕上。

激光物鏡標本共聚焦針孔(Pinhole)光電倍增管(PMT)熒光濾光片

(發(fā)射光濾色片)共聚焦原理掃描？X線上的熒光強度變化多條線構(gòu)成2維圖像OLYMPUS63XY掃描顯微鏡Z顯示器標本標本PMTPC為什么用PMT(光電倍增管)？相比CCD,PMT擁有更高得感光效率更快得讀出速度(微秒級)PMT采集時間信息——電腦還原為位置信息共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡得區(qū)別1、抑制圖像得模糊,獲得清晰得圖像2、具有更高得軸向分辨率,并可獲取連續(xù)光學切片3、增加側(cè)向分辨率4、由于點對點掃描去除了雜散光得影響寬場照明顯微鏡和共聚焦圖像比較激光掃描共焦顯微鏡得設(shè)計特點:1、點照明,激光光源2、具有照明小孔和探測小孔3、照明小孔和探測小孔共軛(共焦),共焦點即被探測點,被探測點所在得平面為共焦平面4、具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像5、無損傷、連續(xù)光學切片,顯微“CT”6、真正得三維重組7、具有多個(四個)熒光通道,可同時探測多個被標記物

激光共聚焦顯微鏡得組成激光共聚焦顯微鏡一般由激光光源,顯微鏡和成像系統(tǒng)三部分組成激光光源Laserlines(Cofocal)405,442,457,477,488,514,543,568,637nm例如:藍光激光二極管405nmexcitation、HQ442/45emissionfilter(DAPI)Applicationse、g、DAPI,HoechstCFPPacificBlueothers…、、

氦-氖激光(

HeNelaser)

543nm,633nm氬激光(

Arlaser)

458,477,488,514,568nm,

顯微鏡UprightMicroscopesNikonE600NikonE800NikonE1000NikonOptiphot2ZeissAxioplan2ZeissAxioskopOlympusBX50/51OlympusBX50WIOlympusBX60OlympusBH2InvertedMicroscopesNikonTE2000,TE300NikonDiaphot300ZeissAxiovert200andTVZeissAxiotechOlympusIX70andTVR激光共聚焦顯微鏡在生物學中得應(yīng)用。組織光學切片三維圖像重建Cy2-anti-basementmembraneproteinCy3anti-neuronalprocessesCy5anti-bloodvesselprotein、多熒光標記分析動物細胞間得胞間通訊研究植物細胞間得胞間通訊研究植物細胞中胞間連絲相關(guān)蛋白Rab11得定位Aconfocalimageofa6-day-oldzebrafish(dorsalview)embryothathasbeendouble-labeledwithantibodiesagainstcelladhesionmoleculesshowsstainingofdifferentsubpopulationsofaxonsinthenervoussystem、、PhotonicSolutionsforBiotechnologyandMedicineNovember2002活體狀態(tài)下細胞得動態(tài)變化擬南芥?zhèn)雀敹朔稚毎梅至鸦罴毎訒r實驗:根據(jù)激光發(fā)生器得不同,目前可分為單光子激光共聚焦顯微鏡(ConfocallaserscanningMicroscopy

)、雙光子激光掃描顯微鏡(

two-photonexcitationMicroscopy)和多光子激光共聚焦顯微鏡(Multi-photonMicr