《mRNA疫苗及藥物中dsRNA雜質(zhì)定量檢測-ELISA法》征求意見稿

T/FDSAXXXX—202XmRNA疫苗及藥物中dsRNA雜質(zhì)定量檢測方法本文件規(guī)范了dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)計(jì)、合成、結(jié)構(gòu)修飾和制備技術(shù)；dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品賦值技術(shù)；dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性考察；抗體對篩選，ELISA方法學(xué)驗(yàn)證和ELISA檢測。本文件適用于基于ELISA方法定量檢測mRNA疫苗和藥物中dsRNA雜質(zhì)的全過程。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T33411-2016酶聯(lián)免疫分析試劑盒通則YY/T1183-2010酶聯(lián)免疫分析試劑盒通則3術(shù)語和定義3.1信使核糖核酸MessengerRNA，mRNAmRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的單鏈核糖核酸，攜帶遺傳信息能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸。在細(xì)胞內(nèi)，mRNA通過與核糖體結(jié)合，并在tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）的幫助下，翻譯成多肽鏈，進(jìn)而形成蛋白質(zhì)。mRNA在基因表達(dá)過程中起著承上啟下的作用，它從DNA傳遞遺傳信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制生物體的生長、發(fā)育和功能。4縮略語dsRNA：雙鏈核糖核酸（double-strandedRNA）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay)HRP：辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase）5dsRNA雜質(zhì)定量檢測方法5.1dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)滿足以下要求：a)應(yīng)為序列隨機(jī)的dsRNA。b)應(yīng)包含多種修飾類型，如無修飾、pUTP修飾、N1-Me-pUTP修飾、5-OMe-UTP修飾，以滿足不同修飾類型mRNA產(chǎn)品中dsRNA雜質(zhì)含量的檢測。c)純度高，以避免雜質(zhì)影響dsRNA精確定量。5.2dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品制備及修飾2T/FDSAXXXX—202XdsRNA制備的基本思路為：PCR獲得轉(zhuǎn)錄模板→體外轉(zhuǎn)錄→退火形成雙鏈→DNA酶和RNA酶處理→醇沉淀→重懸、定量，dsRNA修飾可通過使用相應(yīng)修飾堿基完成。5.3dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品賦值技術(shù)對于dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品的賦值，在驗(yàn)證純度的基礎(chǔ)上，采用UV法或dPCR法進(jìn)行絕對定量。對于有修飾的dsRNA，像pUTP、N1-Me-pUTP和5-OMe-UTP修飾dsRNA，因?yàn)槿鄙傥庀禂?shù)的參考信息，不依賴于吸光系數(shù)的dPCR法定量更具有科學(xué)性和參考性。5.4dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性考察用于ELISA實(shí)驗(yàn)的dsRNA標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，以保證整個試驗(yàn)周期內(nèi)，標(biāo)曲測值不會因標(biāo)準(zhǔn)品放置時間有明顯改變。5.5ELISA抗體對的選擇為了保證對不同序列、長度、修飾類型dsRNA的準(zhǔn)確定量，ELISA實(shí)驗(yàn)中所用的抗體對需進(jìn)行以下驗(yàn)證：a)抗體對應(yīng)特異性識別dsRNA，對其它類型核酸無識別；b)對于同一修飾類型dsRNA，抗體對親和力基本不受長度和序列影響，抗體對對樣本中dsRNA的親和力與標(biāo)準(zhǔn)品的一致程度決定了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.6ELISA方法學(xué)驗(yàn)證所建立的ELISA實(shí)驗(yàn)方法或采用的商用ELISA試劑盒，應(yīng)符合GB/T33411-2016和YY/T1183-2010中關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品溯源、線性、準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度等的要求。5.7ELISA檢測流程5.7.1儀器設(shè)備酶標(biāo)儀、微孔板搖床、RNase-free槍頭、EP管。5.7.2試劑或材料水RNase-free水。洗滌工作液包含0.05%Tween-20的1XPBS溶液，或其它符合要求的溶液。樣本稀釋液可以通過等體積混合0.1MNaCl和1XTE溶液配制樣本稀釋液，也可采用其它符合要求的溶液。5.7.3dsRNA定量檢測包被將捕獲抗體用包被液稀釋至合適濃度，按100μL/孔加至96孔板中，2-8℃過夜孵育。如果采用預(yù)包被有捕獲抗體的96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可省略此步驟。3T/FDSAXXXX—202X加樣標(biāo)準(zhǔn)品和樣本用樣本稀釋液稀釋至合適濃度后，按100μL/孔加至96孔板中。標(biāo)準(zhǔn)品一般稀釋6-8個合適濃度。預(yù)估樣本的濃度范圍，使其稀釋后測值在線性檢測范圍內(nèi)。如果不能確定待測樣品中dsRNA含量，應(yīng)當(dāng)用樣本稀釋液做多個稀釋倍數(shù)測試，以免含量過高或過低不能夠讀取有效數(shù)值孵育用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫下振板（500rpm）反應(yīng)60min（此步驟結(jié)束前5min，可提前配制檢抗工作液）。洗板棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（250μL液體），靜置30s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次。加檢測抗體每孔加入工作濃度的生物素化檢測抗體100μL。孵育用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫下振板（500rpm）反應(yīng)60min（此步驟結(jié)束前5min，可提前配制HRP-鏈霉親和素工作液）。洗板棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（250μL液體），靜置30s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次。加HRP-鏈霉親和素每孔加入工作濃度的HRP-鏈霉親和素100μL。孵育用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫下振板（500rpm）反應(yīng)30min。0洗板棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（250μL液體），靜置30s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次。1顯色每孔加入100μL單組分底物顯色液，用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫靜置避光反應(yīng)30min。2終止每孔加入50μL終止液，立即進(jìn)行檢測，設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450nm處（建議用雙波長450nm/650nm）。5.7.4數(shù)據(jù)分析定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制4T/FDSAXXXX—202XELISA的實(shí)驗(yàn)通常會設(shè)置復(fù)孔，兩個復(fù)孔的OD值取平均值作為該濃度下的OD值。以O(shè)D值作為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為X軸，使用curveexpert1.3或ELISACalc等專業(yè)軟件進(jìn)行Logistic五參數(shù)或四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，應(yīng)保證相關(guān)系數(shù)r2≥0.99。線性范圍的確定以O(shè)D值作為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為X軸，進(jìn)行直線擬合，能滿足直線擬合相關(guān)系數(shù)r2≥0.99的標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為檢測線性范圍。樣本濃度計(jì)算將樣本OD值代入標(biāo)曲方程，由Y計(jì)算X值，得出樣本濃度讀值，如果讀值落在線性范圍內(nèi)，則為有效讀值，若在線性范圍外，為無效讀值。樣本濃度按式（1）進(jìn)行計(jì)算：樣本濃度=(有效讀值1×稀釋倍數(shù)1+有效讀值2×稀釋倍數(shù)2+……+有效讀值n×稀釋倍數(shù)n)/n…………………………(1)5T/FDSAXXXX—202X[1]國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）（2020年08月）[2]國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行2022年05月）[3]USP.AnalyticalProceduresformRNAVaccineQuality（DraftGuidelines2022.02）[4]USP.AnalyticalProceduresformRNAVaccineQuality（DraftGuidelines2023.04）[5]USP.AnalyticalProceduresforQualityofmRNAVaccinesandTherapeutics（DraftGuidelines2024.07）[6]WHO.evaluationofthequality,safetyandefficacyofmessengerRNAvaccinesforthepreventionofinfectiousdiseases:regulatoryconsiderations.2022.04）[7]BijoyitaRoy,MonicaZ.Wu.UnderstandingandOvercomingtheImmuneResponsefromSyntheticmRNAs.GeneticEngineering&BiotechnologyNews.2019Dec19;39(12):56-58.[8]NelsonJ,SorensenEW,MintriS,RabideauAE,ZhengW,BesinG,KhatwaniN,SuSV,MiraccoEJ,IssaWJ,HogeS,StantonMG,JoyalJL.ImpactofmRNAchemistryandmanufacturingprocessoninnateimmuneactivation.SciAdv.2020Jun24;6(26):eaaz6893.[9]ReikineS,NguyenJB,ModisY.PatternRecognitionandSignalingMechanismsofRIG-IandMDA5.FrontImmunol.2014Jul23;5:342.[10]BotosI,LiuL,WangY,SegalDM,DaviesDR.Thetoll-likereceptor3:dsRNAsignalingcomplex.BiochimBiophysActa.2009Sep-Oct;1789(9-10):667-74.[11]AndersonBR,MuramatsuH,NallagatlaSR,BevilacquaPC,SansingLH,WeissmanD,KarikóK.IncorporationofpseudouridineintomRNAenhancestranslationbydiminishingPKRactivation.NucleicAcidsRes.2010Sep;38(17):5884-92.[12]SonenbergN,HinnebuschAG.Regulationoftranslationinitiationineukaryotes:mechanismsandbiologicaltargets.Cell.2009Feb20;136(4):731-45.[13]Stanton,M.G.,Murphy-Benenato,K.E.MessengerRNAasaNovelTherapeuticApproach.InRNATherapeutics.TopicsinMedicinalChemistry,:Garner,A.Ed.(SpringerInternationalPublishing,2017),27:237-253[14]USP.AnalyticalProceduresformRNAVaccineQualityDraftguidelines[15]Sch?nbornJ,OberstrassJ,BreyelE,TittgenJ,SchumacherJ,LukacsN.Monoclonalantibodiestodouble-strandedRNAasprobesofRNAstructureincrudenucleicacidextracts.NucleicAcidsRes.1991Jun11;19(11):2993-3000.[16]Chaudhary,N.,Weissman,D.&Whitehead,K.A.mRNAvaccinesforinfectiousdiseases:principles,deliveryandclinicaltranslation.NatRevDrugDiscov.2021,20,817–838.[17]MuX,GreenwaldE,AhmadS,HurS.AnoriginoftheimmunogenicityofinvitrotranscribedRNA.NucleicAcidsRes.2018Jun1;46(10):5239-5249.[18]KarikóK,MuramatsuH,WelshFA,LudwigJ,KatoH,AkiraS,WeissmanD.IncorporationofpseudouridineintomRNAyieldssuperiornonimmunogenicvectorwithincreasedtranslation