總膽固醇測定試劑注冊技術審查指導原則（2022年）

總膽固醇測定試劑注冊技術審查指導原則（2022年）本指導原則是在現行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。一、適用范圍本指導原則所指的總膽固醇測定試劑是指利用CHOD-PAP法對人血清、血漿等樣本中總膽固醇含量進行體外定量測定的試劑。目前，總膽固醇測定已有完整的參考系統(tǒng)：其決定性方法為同位素稀釋質譜法，參考方法為正己烷抽提L-B反應顯色法（ALBK法）或色譜法，常規(guī)測定方法為酶法。酶法主要包括膽固醇氧化酶法和膽固醇脫氫酶法，其中膽固醇氧化酶-PAP法是目前應用最為廣泛的常規(guī)測定方法。依據YY/T1227-2022《臨床化學體外診斷試劑（盒）命名》的要求，將膽固醇氧化酶-PAP法規(guī)范表述為CHOD-PAP法。本指導原則適用于采用CHOD-PAP法測定的試劑，不適用于脫氫酶法和干化學法測定的試劑，但適用處可參照執(zhí)行。依據《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）、《食品藥品監(jiān)管總局關于印發(fā)體外診斷試劑分類子目錄的通知》（食藥監(jiān)械管〔2022〕242號），總膽固醇測定試劑屬于酯類檢測試劑，管理類別為Ⅱ類，分類編碼為6840。本指導原則適用于進行產品注冊和相關許可事項變更的產品。1.產品預期用途總膽固醇是指血液中各脂蛋白所含膽固醇之總和，分為酯化型膽固醇（又稱膽固醇酯，CE）和游離型膽固醇（FC），其中CE占60%~70%，FC占30%~40%，健康個體之間兩種類型的比例保持穩(wěn)定。膽固醇是合成腎上腺皮質激素、性激素、膽汁酸以及維生素D等生理活性物質的重要原料，也是構成細胞膜的主要成分，其濃度可作為脂代謝的指標。定量測定人體樣本中總膽固醇含量，臨床主要用于心血管疾病的危險分析，高TC血癥是冠心病的主要危險因素之一。病理狀態(tài)下，高TC有原發(fā)與繼發(fā)兩類，原發(fā)的如家族性高膽固醇血癥（低密度脂蛋白受體缺陷）、家族性apoB缺陷癥、多源性高TC、混合性高脂蛋白血癥。繼發(fā)的多見于腎病綜合征、甲狀腺功能減退、糖尿病、妊娠等。低TC血癥也有原發(fā)性的與繼發(fā)的，前者如家族性的無或低β脂蛋白血癥，后者如甲亢、營養(yǎng)不良、慢性消耗性疾病等。3.有關生物安全性方面的說明如試劑中主要原材料由各種動物、病原體、人源組織和體液等生物材料經處理或添加某些物質制備而成，為保證產品在運輸、使用過程中對使用者和環(huán)境的安全，研究者應提供上述原材料有關生物安全性的說明或證明文件。4.有關產品主要研究結果的總結和評價。5.其他包括同類產品在國內外批準上市的情況，相關產品所采用的技術方法及臨床應用情況，申請注冊產品與國內外同類產品的異同等。對于總膽固醇測定試劑，分析性能應包括試劑空白吸光度、線性范圍、準確度、分析靈敏度、精密度、分析特異性、其他影響檢測的因素等。1.試劑空白吸光度用指定空白樣品（如純化水、生理鹽水等）加入工作試劑作為樣品，在試劑規(guī)定主波長下測試吸光度值，重復兩次，均值即為空白吸光度。雙試劑型試劑應不大于0.080，單試劑型試劑應不大于0.100。2.線性范圍2.1線性范圍的建立申請人建立試劑線性范圍所用的樣本基質應盡可能與臨床實際檢測的樣本相似，理想的樣本為分析物濃度達到預期測定上限的混合人源樣本，制備低濃度樣本時應充分考慮稀釋對樣本基質的影響。建立線性范圍時，需在預期測定范圍內選擇7～11個濃度水平。例如，將預期測定范圍加寬至130%，在此范圍內選擇更多的濃度水平，然后依據實驗結果逐漸減少數據點（最終不得少于7個水平）直至表現出線性關系，可發(fā)現最寬的線性范圍。2.2線性范圍的驗證2.2.1用接近線性范圍上限的高濃度樣本和接近線性范圍下限的低濃度樣本，混合成至少5個稀釋濃度（xi）。分別測試樣本，每個稀釋濃度測試3次，求出每個稀釋濃度測定結果的均值（yi）。以稀釋濃度（xi）為自變量，以測定結果均值（yi）為因變量求出線性回歸方程。計算線性回歸的相關系數（r），r≥0.9900。2.2.2用2.2.1方法中稀釋濃度（xi）代入求出線性回歸方程，計算yi的估計值及yi與估計值的絕對偏差或相對偏差，應符合申請人給定值。3.準確度測試可用于評價常規(guī)方法的國家/國際標準物質3次，測試結果記為（xi），按公式（1）分別計算相對偏差（B%），如果3次結果都在±10%范圍內，即判為合格。如果大于等于2次的結果不符合，即判為不合格。如果有1次結果不符合，則應重新連續(xù)測試20次，并分別按照公式（1）計算相對偏差（B%），如果大于等于19次測試的結果都在±10%范圍內，即判為合格。B%＝|xi－T|／T×100%………………（1）

式中：

xi為測試結果；

T為國家/國際標準物質標示值。4.分析靈敏度測試給定濃度的被測物時，在規(guī)定參數下所得的吸光度差值（ΔA）應符合申請人給定的范圍。5.精密度5.1批內精密度重復測試不同濃度（如高、中、低）的質控品或樣本10次，所得結果的變異系數（CV）應不大于4.0%。5.2批間差選取3個不同批次的試劑，測試不同濃度（如高、中、低）的質控品或樣本，每個批號測定3次，批間相對極差（R）應不大于6.0%。6.分析特異性應明確已知干擾因素對測定結果的影響：對膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、抗壞血酸等干擾物質分別進行驗證。說明樣本的制備方法及實驗的評價標準，確定干擾物質的接受標準。注冊申請中包含不同的包裝規(guī)格，需要對不同包裝規(guī)格之間的差異進行分析或驗證，如不同包裝規(guī)格產品間存在性能差異，需要提交采用每個包裝規(guī)格產品的分析性能評估。如不同包裝規(guī)格之間不存在性能差異，需要提交包裝規(guī)格之間不存在性能差異的詳細說明，具體說明不同包裝規(guī)格之間的差別及可能產生的影響。產品說明書【參考區(qū)間】的相應描述應與研究結論保持一致。試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內容的研究結果應分別在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。1.1研究方法總膽固醇測定試劑盒目前已有相應的參考方法（ALBK法、色譜法等）和境內已上市同類產品，申請人可以選擇其中一種方法開展比較研究試驗。與參考方法進行比較研究試驗，考察待評價試劑與參考方法的一致性。一致性評價應選擇在參考實驗室開展研究，參考實驗室應具有中國合格評定國家認可委員會認可關于該項目的檢測資質。與境內已上市同類產品進行比較研究試驗，證明兩者具有等效性。應選擇目前臨床普遍認為質量較好的產品作為對比試劑，同時應充分了解對比試劑的信息，包括方法學、預期用途、主要性能指標、校準品的溯源情況以及參考區(qū)間等，并提供已上市產品的境內注冊信息及說明書。1.2試驗設計申請人應根據申請注冊產品的特性建立具體的試驗方案，并詳細說明對比試劑/方法的選擇、入排標準、樣本量要求以及具體試驗操作過程、試驗周期、設盲要求、統(tǒng)計分析方法等內容。樣本數量應采用合理的統(tǒng)計學方法（如目標值法等）進行計算，并符合統(tǒng)計學要求?？蛇x擇總樣本量不少于40例并分別采用待評價試劑和對比試劑/參考方法進行雙份測定的方式，亦可選擇總樣本量不少于100例并分別采用待評價試劑和對比試劑/參考方法進行單次測定的方式。其中參考區(qū)間以外樣本應不少于50%，同時應注重醫(yī)學決定水平（6.2mmol/L）附近樣本的選擇，并盡量涵蓋檢測范圍。試驗前應設定臨床評價性能指標的可接受標準,如果比較研究試驗結果無法達到預設標準，則應適當擴大樣本量進行評價。評價用的樣本類型應與注冊申請保持一致。對于具有可比性的不同樣本類型，如血清和血漿樣本，可在分析性能評估中對樣本適用性進行研究，或在臨床評價中對每種樣本類型分別進行符合統(tǒng)計學意義數量的評估。1.2.2試驗操作及周期申請人可以通過對總樣本量不少于40例，用待評價試劑和對比試劑/參考方法進行平行試驗，對每份臨床樣本作雙份測定。在試驗操作過程中應對樣本進行編盲，試驗檢測周期至少為5天。申請人也可以通過對總樣本量不少于100例，用待評價試劑和對比試劑/參考方法進行平行試驗，作單次測定。在試驗操作過程中應對樣本進行編盲，試驗檢測周期至少為5天。1.2.3數據收集和處理應首先進行離群值觀察，離群值的個數不得超過限值。若未超限，可刪除離群值后進行分析；

若超出限值，則需合理分析原因并考慮糾正措施，必要時重新收集樣本進行分析。離群值分析和處理方法應有依據。1.2.4統(tǒng)計學分析對試驗結果的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如相關分析、線性回歸、偏倚/偏差分析等。對于對比試驗的等效性研究，最常用是對待評試劑和對比試劑/參考方法兩組檢測結果的相關及線性回歸分析，應重點觀察相關系數（r值）或判定系數（R2）、回歸擬合方程（斜率和y軸截距）等指標。1.3.2試驗設計，詳細說明對比試劑/方法選擇、樣本入組和排除標準、樣本量要求、設盲要求、統(tǒng)計分析方法的選擇等內容。評價報告應由申請人/代理人簽章。2.臨床試驗途徑臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應符合相關法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求。（九）產品技術要求申請人應當在原材料質量和生產工藝穩(wěn)定的前提下，根據產品前期研究的結果，依據國家標準、行業(yè)標準及有關文獻，按照《關于發(fā)布醫(yī)療器械產品技術要求編寫指導原則的通告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2022年第9號）的有關要求，擬定產品技術要求，內容主要包含產品性能指標和檢驗方法。下面就產品技術要求中涉及的產品適用的相關標準和主要性能指標等相關內容作簡要敘述。1.產品適用的相關標準：

表1相關產品標準GB/T21415-2022《體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》

GB/T26124-2022《臨床化學體外診斷試劑（盒）》

YY/T1206-2022《總膽固醇測定試劑盒（氧化酶法）》

WS/T362-2022《血清膽固醇參考測量程序分光光度法》

WS/T120-1999《血清總膽固醇的酶法測定》

2.主要性能指標：

2.1外觀符合申請人規(guī)定的外觀要求。2.2裝量液體試劑的裝量應不少于標示量。2.3試劑空白吸光度用指定空白樣品（如純化水、生理鹽水等）加入工作試劑作為樣品，在試劑盒規(guī)定主波長下測試吸光度值，重復兩次，均值即為空白吸光度。雙試劑型試劑盒應不大于0.080，單試劑型試劑盒應不大于0.100。2.4線性范圍線性范圍應至少包含2～10mmol/L。2.4.1相關系數（r）

線性相關系數r應不小于0.9900。2.4.2線性偏差線性偏差應不超過申請人給定值。線性偏差可分段描述或連續(xù)描述，若分段描述，應注意分段點的確定。2.5準確度試劑盒測試可用于評價常規(guī)方法的國家/國際標準物質3次，測試結果記為（xi），按公式（1）分別計算相對偏差（B%），如果3次結果都在±10%范圍內，即判為合格。如果大于等于2次的結果不符合，即判為不合格。如果有1次結果不符合，則應重新連續(xù)測試20次，并分別按照公式（1）計算相對偏差（B%），如果大于等于19次測試的結果都在±10%范圍內，即判為合格。B%＝|xi－T|／T×100%………………（1）

式中：

xi為測試結果；

T為國家/國際標準物質標示值。2.6分析靈敏度試劑盒測試給定濃度的被測物時，在試劑盒規(guī)定參數下所得的吸光度差值（ΔA）應符合申請人給定的范圍。2.7精密度2.7.1批內精密度重復測試不同濃度（如高、中、低）的質控品或樣本10次，所得結果的變異系數（CV）應不大于4.0%。2.7.2批間差選取3個不同批次的試劑盒，測試不同濃度（如高、中、低）的質控品或樣本，每個批號測定3次，試劑盒批間相對極差（R）應不大于6.0%。2.8穩(wěn)定性2.8.1效期末穩(wěn)定性試劑盒在規(guī)定的保存條件下保存至有效期末進行檢驗，產品性能應符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7.1的要求。2.8.2加速穩(wěn)定性根據試劑盒的有效期，將試劑盒放置于37℃條件下，一定時間（通常是3d～7d）后進行檢驗，產品性能應符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7.1的要求。注1：熱穩(wěn)定性不能用于推導產品有效期，除非是采用基于大量的穩(wěn)定性研究數據建立的推導公式。注2：根據產品特性可選擇以上方法之一進行驗證，但所選用方法宜能驗證產品的穩(wěn)定性，以保證在效期內產品性能符合產品技術要求的規(guī)定。2.9校準品和質控品（如適用）

應包含外觀、裝量（如適用）、準確度、均一性、穩(wěn)定性。2.9.1外觀符合申請人規(guī)定的外觀要求。2.9.2裝量液體校準品和質控品的裝量應不少于標示量。2.9.3準確度2.9.3.1校準品準確度申請人可采用國家/國際標準物質/具有溯源性的工作校準品作校準曲線后測定校準品的方法，計算測試結果與標示值的相對偏差，其結果應在±10.0%范圍內。2.9.3.2質控品準確度測定定值質控品，測試結果應在申請人給定的范圍內。2.9.4均一性取相同批號的校準品或質控品10瓶，每瓶測試1次，按公式（2）和公式（3）計算測試結果的平均值（）和標準差S1；

另用上述校準品或質控品中的1瓶連續(xù)測10次，計算測試結果的平均值（）和標準差S2；

再按公式(4)和公式(5)計算S瓶間和CV瓶間，其結果應符合申請人的規(guī)定?！?）

………（3）

……………（4）

………（5）

當S1<S2時，令CV瓶間=0式中：----平均值；

S----標準差；

n----測量次數；

xi----指定參數第i次測量值。2.10穩(wěn)定性校準品、質控品在規(guī)定的保存條件下保存至有效期末進行檢驗，性能應符合準確度和均一性的要求。（十）產品注冊檢驗報告具有相應醫(yī)療器械檢驗資質和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構出具的注冊檢驗報告和產品技術要求預評價意見?？偰懝檀柬椖磕壳坝袊?國際標準物質，建議使用國家/國際標準物質進行注冊檢驗。（十一）產品說明書說明書承載了產品預期用途、檢驗方法、檢驗結果的解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。結合《關于發(fā)布體外診斷試劑說明書編寫指導原則的通告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2022年第17號）的要求，下面對總膽固醇測定試劑盒說明書的重點內容進行詳細說明。1.【產品名稱】試劑盒名稱由三部分組成：被測物質的名稱、用途、方法或原理。如：總膽固醇測定試劑盒（CHOD-PAP法）。2.【包裝規(guī)格】2.1包裝規(guī)格應明確單、雙或其他多試劑類型。2.2包裝規(guī)格應注明可測試的樣本數或裝量，如xx測試/盒、xxmL。2.3如有貨號，可增加貨號信息。3.【預期用途】應至少包括以下內容：

3.1說明試劑盒用于體外定量測定人血清、血漿等樣本中總膽固醇的含量。3.2明確與總膽固醇測定相關的臨床適應癥背景情況。4.【檢驗原理】標本中的膽固醇酯被膽固醇酯酶（CHER）水解為游離膽固醇，和標本中存在的游離膽固醇一起被膽固醇氧化酶（CHOD）氧化為膽甾烯酮和過氧化氫，后者再經過氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林和酚發(fā)生氧化縮合反應，生成紅色醌亞胺(稱Trinder反應，或稱PAP反應)。標本中的膽固醇含量和生成的醌亞胺呈正比，500nm左右波長檢測醌亞胺的吸光度，對照校準物即可計算出標本中的總膽固醇含量，其反應式如下：

5.【主要組成成分】應明確以下內容：

5.1說明試劑盒包含組分的名稱、比例或濃度；

對于多組分試劑盒，應明確不同批次試劑中各組分是否可以互換。5.2對于試劑盒中不包含，但對該試驗必需的試劑組分，說明書中應列出此類組分的名稱、純度，提供稀釋或混合方法及其他相關信息。6.【儲存條件及有效期】6.1說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性（如適用）、復溶穩(wěn)定性（如適用）等，并標明儲存條件。注：儲存條件不應有模糊表述，如“室溫”、“常溫”。7.【適用儀器】應明確可適用儀器的具體品牌、型號。8.【樣本要求】重點明確以下內容：樣本類型、處理、保存期限及保存條件等，如有血漿樣本，應明確抗凝劑的要求。冷藏樣本檢測前是否須恢復室溫，冷凍樣本應明確凍融次數。對已知干擾物進行說明并明確不產生干擾的最高濃度，如：膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯、抗壞血酸。9.【檢驗方法】詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

9.1試劑配制方法、注意事項。9.2試驗條件：測定方法（反應類型）、反應方向、溫度、測定主/副波長、樣本用量、試劑用量、空白/測定讀數時間以及試驗過程中的注意事項。9.3校準：說明使用的校準品，校準曲線的繪制方法。9.4質量控制：說明質控品的使用、質量控制方法、質控頻率。9.5檢驗結果的計算：應明確檢驗結果的計算方法。10.【參考區(qū)間】應注明樣本類型的參考區(qū)間，并簡要說明其確定方法。建議注明“由于地理、人種、性別和年齡等差異，建議各實驗室建立自己的參考區(qū)間”。11.【檢驗結果的解釋】說明可能對檢驗結果產生影響的因素，在何種情況下需要進行確認試驗，如檢驗結果出現與臨床不符甚至相悖的情況，應分析查找原因并重新確認等。12.【檢驗方法的局限性】如試劑盒可稀釋，應明確當測定值超出線性上限時的稀釋方法以及最大稀釋倍數。說明該檢驗方法的