T載體與目的基因連接

/一.重組質(zhì)粒的構(gòu)建T質(zhì)粒載體重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4DNA連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3’端加上一個突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3’端帶有一個突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。二.感受態(tài)制備原理細菌在0°CCaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)。三.β-半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，可以編碼β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解．用X-Gal為底物進行染色時，呈藍色。現(xiàn)在一些特定的質(zhì)粒（比如pUC/pBS等），常帶有β—半乳糖核苷酶的調(diào)控序列和β—半乳糖核苷酶N端146個氨基酸（α肽段）的編碼序列，在這個編碼序列里還插入一個多克隆位點（MCS）,它并不影響lacZ的表達。另外，常用的大腸桿菌帶有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的編碼序列。在各自獨立的情況下，這些質(zhì)粒與大腸桿菌各自編碼的β—半乳糖核苷酶片段都沒有酶的活性。只有當攜帶α肽編碼信息的克隆載體成功進入宿主細胞，在培養(yǎng)基誘導(dǎo)物IPTG的誘導(dǎo)下，載體質(zhì)粒能夠合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），這樣就與宿主細胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互補，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。而當外源基因插入到此種載體質(zhì)粒lacZ的多克隆位點后，會造成lacZ基因不能表達，從而不能合成β—半乳糖核苷酶；而對于空載體，lacZ基因正常表達，通過α互補合成β—半乳糖核苷酶，分解培養(yǎng)基里的色素底物X-gal，最終形成藍色的化合物，出現(xiàn)藍色菌斑。實驗準備：清洗，5個100ml錐形瓶（外加1個小的），6副培養(yǎng)皿，3個小試劑瓶，接種環(huán)，涂布棒。準備100ml超純水。溶液:LB300ml(液體50ml+50ml，固體100ml)，0.1mol/LCaCl210ml，100mg/mlAmp1ml，20mg/mlX-gal1ml，200mg/mlIPTG1ml。大腸桿菌菌液1ml。感受態(tài)細胞連接產(chǎn)物4管4x5=20ul做4份目的基因T載體T4連接酶10x沖液4x4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL滅菌：5個100ml錐形瓶（外加1個小的），6副培養(yǎng)皿，3個小試劑瓶，接種環(huán)，涂布棒，10ml超純水，LB培養(yǎng)基，1.5mlEP管，大小槍頭，過濾用具2副，，0.1mol/LCaCl2實際配置20mg/mlX-galX-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml（取0.02gX-gal，用DMF定容為1ml）的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。（DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS：68-12-2理化性質(zhì):無色、淡的胺味的液體。分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相對密度0.9445(25℃)。熔點-61℃。沸點152.8℃。）溶于DMSO，溶解度可達20mg/ml。也溶于DMF溶于DMSO，溶解度可達20mg/ml。也溶于DMF200mg/mlIPTG在0.8ml蒸餾水中溶解0.2gIPTG后，用蒸餾水定容至1ml，用0.22μm濾器過濾除菌，貯存于-20℃。LB培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)該在950ml去離子水中加入:胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g搖動容器直至溶質(zhì)溶解.用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.3.用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.（100mlLB培養(yǎng)基加入1.5g瓊脂粉為固體培養(yǎng)基）0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化鈣固體定容至10mlAmp（100mg/ml）：溶解0.1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22μm濾膜過濾除菌.實驗過程（一）.目的基因片段與載體連接器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面離心管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴。試劑T載體，T4DNA連接酶，連接酶緩沖液，無菌ddWater。操作步驟PCR產(chǎn)物與T載體直接連接：（1）事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在14~16°C。（2）取4個滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調(diào)整）4ml目的基因；1mlT載體；0.5mlT4DNA連接酶（TAKARA,350U/ul）；1ml連接酶緩沖液10xbuffer；3.5mlddWater，總量10ml體系。（3）述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14°C干式恒溫儀（或14°C水中）中保溫過夜（12-16h）。（4）連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞或置4°C冰箱備用。（二）.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備細菌轉(zhuǎn)化儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml微量離心管，1.5ml微量離心管，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過濾器試劑：E.coli菌種，LB培養(yǎng)基，0.1mol/LCaCl2溶液，無菌ddWater，LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddwater，IPTG，X-gal。步驟（1）在超凈工作臺中，將1ml大腸桿菌菌液加入100mlLB液態(tài)培養(yǎng)基（不含抗菌素），37℃搖床培養(yǎng)過夜。（2）取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h，測定OD590為0.35~0.4左右（<0.4~0.6，細胞數(shù)<108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)！）。（注意：此步搖菌的時候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時搖菌）（3）將1ml菌液加入到4支1.5mL預(yù)冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm離心5min。（4）將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。（5）4℃，5000rpm離心5min，棄上清液后，用100μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂懸，插入冰中放置2h，可以直接用作轉(zhuǎn)化實驗，或立即放入-4攝氏度冰柜中保藏。（6）事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。（7）從-70℃超低溫冰柜中取出一管（100μL）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。（8）加入5μL連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。（9）輕輕搖勻后插入42℃水浴中90s進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3min。（10）在超凈工作臺中向上述各管中分別加入300μLLB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。（11）在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液200μL，分別滴到含合適抗菌素（Amp100ug/L）的固體LB平板培養(yǎng)皿中，再在平板上滴加40μL20mg/mlX-gal，7μL200mg/mlIPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：一個不含抗生素作為對照組，玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。）。（12）在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。（13）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。（14）觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。（三）.轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。試劑LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶與其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/LMgSO4，0.025mol/LTrisClpH8.0）。操作步驟方法一：快速PCR篩選法（1）在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機選取4個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。（2）在0.2mlPCR微量離心管中配制25μl反應(yīng)體系。ddwater16μl10×PCRbuffer（不含MgCl2）2.5μl25mMMgCl21.5μl2.5mmol/LdNTP2μl（每種dNTP終濃度0.2mM）10μmol/LPrimer11μl（12.5—25pmoles）10μmol/Lprimer21μl（12.5—25pmoles）模板質(zhì)粒用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq酶0.5μl（1.5u）總體積25μl（2）根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序（本實驗室已經(jīng)設(shè)置為WZ）：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10min（2）PCR結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時比對）。觀察膠上是否有預(yù)計的主要產(chǎn)物帶。（3）按照編號找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒（4）提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對比電泳，以進一步確認。方法二：提質(zhì)粒再PCR或酶切鑒定（1）在超凈工作臺中取3支無菌搖菌管，各加入3mLLB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號筆寫好編號。（2）在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mLLB