CSTM LX 9802 00999-2022《玉米褪綠斑駁病毒 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 透射電子顯微鏡法》編制說(shuō)明

一、工作簡(jiǎn)況

1.任務(wù)來(lái)源

本標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)中國(guó)材料與試驗(yàn)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)：CSTM標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)）科學(xué)試驗(yàn)領(lǐng)

域委員會(huì)審查，CSTM標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)于2022年6月批準(zhǔn)《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)透

射電子顯微鏡法》立項(xiàng)。標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目歸口管理委員會(huì)為CSTM/FC98/TC02科學(xué)試驗(yàn)領(lǐng)域委員會(huì)

科學(xué)試驗(yàn)創(chuàng)新方法技術(shù)委員會(huì)，標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃編號(hào)為CSTMLX980200999—2022，由浙江大學(xué)

牽頭承擔(dān)《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)透射電子顯微鏡法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。

2.標(biāo)準(zhǔn)制定的背景和目的

玉米褪綠斑駁病毒（Maizechloroticmottlevirus,MCMV）是侵染玉米、小麥、大麥、

燕麥、高粱、甘蔗等禾本科作物的重要檢疫性病毒病原，被列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植

物檢疫性有害生物名錄》，是我國(guó)各地植物保護(hù)檢疫機(jī)構(gòu)嚴(yán)密監(jiān)控的對(duì)象。該病毒多年來(lái)在

各地出入境口岸時(shí)有檢出，2009年在我國(guó)云南元謀縣大田玉米上發(fā)生玉米致死壞死?。╟orn

lethalnecrosis，CLN），浙江大學(xué)謝禮等運(yùn)用電子顯微鏡觀(guān)察、血清學(xué)檢測(cè)和分子鑒定技術(shù)，

首次報(bào)道了該病病原的鑒定結(jié)果，確定主要病原為MCMV（LiXie，2011），這是在中國(guó)境

內(nèi)第一次發(fā)現(xiàn)MCMV危害大田農(nóng)作物。2015年國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化

管理委員會(huì)頒布了我國(guó)第一部《玉米退綠斑駁病毒檢疫鑒定方法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T

31810-2015），成為玉米退綠斑駁病毒檢疫檢測(cè)工作的規(guī)范。在這部標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了基于血

清學(xué)技術(shù)的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

檢測(cè)等技術(shù)方法，但沒(méi)有涉及到應(yīng)用電子顯微鏡檢測(cè)診斷MCMV的技術(shù)方法。

病毒是自然界最小的生命形式，必須借助于透射電子顯微鏡才能顯示其形態(tài)結(jié)構(gòu)，在

病毒病原的檢測(cè)診斷中，往往強(qiáng)調(diào)“眼見(jiàn)為實(shí)”，形態(tài)結(jié)構(gòu)是診斷病毒種類(lèi)的重要依據(jù)。

通常情況下運(yùn)用負(fù)染色和超薄切片電鏡觀(guān)察就能診斷和鑒別植物病毒，一般可以診斷到屬

的水平，有的細(xì)胞病變特征還能幫助鑒別到病毒的種。在出入境檢驗(yàn)檢疫工作中，對(duì)于植

物病毒除了需要抗體檢測(cè)或分子檢測(cè)的證據(jù)外，還需要病毒粒子的形態(tài)照片。即使在日常

的植物病毒研究工作中，常常也需要電鏡的形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)佐證。MCMV是類(lèi)番

茄叢矮病毒目（Tolivirales）、番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪綠斑駁病毒屬

（Machlomovirus）的唯一成員，為直徑30nm的二十面體球狀病毒，在玉米病株細(xì)胞內(nèi)含

量極高，其組織粗汁液經(jīng)負(fù)染色后在透射電鏡下很容易觀(guān)察到。該病毒還引起細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧

化物酶體和線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)改變，過(guò)氧化物酶體產(chǎn)生周邊復(fù)制小泡，線(xiàn)粒體囊泡化病變，在其

囊泡結(jié)構(gòu)中積累大量纖維狀物質(zhì)，隨著線(xiàn)粒體崩解，纖維狀物質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)，是鑒別

MCMV的重要細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)特征。我們自2009年起研究MCMV，先后承擔(dān)了農(nóng)業(yè)部公益

性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)“稻麥重要病毒病株系鑒定和防控技術(shù)體系研究”，國(guó)家自然科

1

學(xué)基金面上項(xiàng)目“兩種二十面體植物病毒的低溫電鏡三維重構(gòu)研究”等項(xiàng)目，建立了MCMV

單克隆抗體ELISA快速檢測(cè)方法，在國(guó)際上首次運(yùn)用低溫電鏡研究MCMV的三維空間結(jié)

構(gòu)。在日常接受大田病樣和入境抽檢樣品的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)采用透射電鏡對(duì)田間玉米病樣進(jìn)

行負(fù)染色快速檢測(cè)，結(jié)合超薄切片觀(guān)察組織細(xì)胞病理變化，可以準(zhǔn)確診斷MCMV，與抗體

檢測(cè)結(jié)果的吻合度非常高。即使是玉米種子病毒含量較少的情況下，也可以通過(guò)免疫吸附

電鏡技術(shù)來(lái)富集病毒，提高病毒的檢出率。在當(dāng)前快遞業(yè)非常發(fā)達(dá)的情況下，基層農(nóng)業(yè)機(jī)

構(gòu)和農(nóng)戶(hù)可以通過(guò)快遞郵寄病樣到專(zhuān)業(yè)電鏡實(shí)驗(yàn)室，可以較快地得到檢測(cè)結(jié)果。

透射電鏡為大型精密儀器，技術(shù)要求較高，用透射電鏡技術(shù)檢測(cè)植物病毒雖然廣泛應(yīng)

用于高等院校、科研院所、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，但由于各個(gè)電鏡實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的差異，在具

體操作上缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，往往造成檢測(cè)結(jié)果差別很大。迄今為止還沒(méi)有一個(gè)國(guó)家或者行業(yè)

標(biāo)準(zhǔn)可用于規(guī)范MCMV的電鏡檢測(cè)分析，我們也沒(méi)有查到相應(yīng)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要

先制定一部規(guī)范MCMV透射電鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)診斷的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，把關(guān)鍵的樣品前處理程序以

及電鏡判定標(biāo)準(zhǔn)確定下來(lái)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。鑒于此，我們?cè)陂L(zhǎng)期從事

植物病毒研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國(guó)的實(shí)際情況，提出了制定《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)

學(xué)檢測(cè)透射電子顯微鏡法》的計(jì)劃。該標(biāo)準(zhǔn)的制定有助于規(guī)范MCMV的透射電鏡檢測(cè)診

斷，可在高等院校、科研院所、基層企事業(yè)單位的電鏡實(shí)驗(yàn)室宣貫推廣，該標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)內(nèi)首

個(gè)MCMV形態(tài)學(xué)電鏡檢測(cè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

3.工作主要過(guò)程

（1）起草階段：

在以往工作的基礎(chǔ)上，聯(lián)合云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、珠海市拱北海關(guān)技術(shù)中心、上海市海

關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心等單位組建成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，確定了標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)原

則和分工，提出標(biāo)準(zhǔn)編制進(jìn)度安排。于2022年6月完成《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)透

射電子顯微鏡法》初稿，經(jīng)過(guò)相關(guān)合作單位的意見(jiàn)征詢(xún)以及部分實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充驗(yàn)證，于2022年

9月完成征求意見(jiàn)稿。

（2）征求意見(jiàn)階段：

2022年10月通過(guò)CSTM網(wǎng)上系統(tǒng)遞交《玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測(cè)透射電子顯微

鏡法》征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明，廣泛征求意見(jiàn)。

4.主要參加單位及工作組成員

主要參加單位包括：浙江大學(xué)，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，珠海市拱北海關(guān)技術(shù)中心，上海

市海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。

工作組成員包括：洪健，謝禮，王華，李云琴，尚衛(wèi)娜，吳建祥、張仲凱、張衛(wèi)東、

于翠。

二、標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)象簡(jiǎn)要情況及制修訂標(biāo)準(zhǔn)的原則

2

1.標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)象簡(jiǎn)要情況

本標(biāo)準(zhǔn)為旨在規(guī)范本領(lǐng)域內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)的制修訂和發(fā)布。

2.制修訂標(biāo)準(zhǔn)的原則

（1）制修訂標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)或理由

依據(jù)中國(guó)材料與試驗(yàn)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂管理細(xì)則、中關(guān)村材料試驗(yàn)聯(lián)盟團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦

法（試行）制定本標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范本領(lǐng)域內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)的制修訂和發(fā)布。

（2）制修訂標(biāo)準(zhǔn)的原則

本標(biāo)準(zhǔn)編制遵循經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展需求原則、技術(shù)先進(jìn)和經(jīng)濟(jì)合理原則、適應(yīng)貿(mào)易全球化

需求原則、維護(hù)公眾利益原則、協(xié)商一致原則、廣泛參與和公開(kāi)透明原則。本標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)構(gòu)

編寫(xiě)和內(nèi)容編排等方面依據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的

結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》進(jìn)行編寫(xiě)。

三、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的情況

無(wú)

四、標(biāo)準(zhǔn)制定的原則與主要技術(shù)內(nèi)容

植物病毒的透射電鏡形態(tài)檢測(cè)主要采用負(fù)染色技術(shù)、超薄切片技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)，

這些技術(shù)方法是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐證明穩(wěn)定可靠的通用性方法，所制備的植物病毒樣品適用于

各種型號(hào)的生物透射電鏡觀(guān)察。因此，我們?cè)诰幹茦?biāo)準(zhǔn)具體條款時(shí)，主要列舉了樣品制備

的過(guò)程和要求，對(duì)于透射電鏡，只列出了觀(guān)察條件的選擇原則，針對(duì)某一臺(tái)儀器的具體操

作步驟建議參照儀器操作說(shuō)明書(shū)。在樣品前處理程序中，列舉了負(fù)染色技術(shù)、超薄切片技

術(shù)、免疫電鏡技術(shù)的基本步驟，涉及樣品前處理過(guò)程所用到的制樣設(shè)備如超薄切片機(jī)、玻

璃制刀機(jī)、包埋聚合器、高速離心機(jī)的具體操作步驟也建議參照儀器說(shuō)明書(shū)。

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了應(yīng)用透射電鏡對(duì)玉米褪綠斑駁病毒進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)的技術(shù)要求與規(guī)范，

標(biāo)準(zhǔn)適用于該病毒的檢驗(yàn)檢疫以及田間樣品的形態(tài)學(xué)診斷鑒定。主要內(nèi)容包括：

1范圍

2規(guī)范性引用文件

3術(shù)語(yǔ)和定義

4原理

5儀器設(shè)備、試劑和材料、環(huán)境條件

6樣品

7檢測(cè)步驟

8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

9檢測(cè)結(jié)果發(fā)布

附錄A玉米褪綠斑駁病毒相關(guān)資料

附錄B常用試劑配方

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附錄C玉米褪綠斑駁病毒電鏡照片

附錄D起草單位和主要起草人

五、試驗(yàn)驗(yàn)證分析

1.負(fù)染色電鏡觀(guān)察：將采自云南呈明顯癥狀的玉米病葉剪碎，在研缽中加0.05mol/L磷

酸緩沖液研磨后用覆Formvar膜的電鏡銅網(wǎng)蘸取組織粗汁液，經(jīng)2%磷鎢酸（pH6.7）負(fù)染

色。將帶病毒的種子種皮加磷酸緩沖液研磨后，經(jīng)2%磷鎢酸（pH6.7）負(fù)染色。

2.免疫吸附電鏡觀(guān)察：將銅網(wǎng)膜面朝下放置于1:10~1:100倍稀釋的MCMV抗體抗體

液滴上保濕孵育15min，用20滴0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH值7.0）滴洗銅網(wǎng)，洗除多

余抗體。用濾紙片吸掉余液后，將銅網(wǎng)放置于病毒樣品懸液滴上保濕孵育30min（如種子

的病毒含量低，反應(yīng)時(shí)間可延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)或過(guò)夜）。用20滴0.05mol/L的磷酸緩沖液、30

滴雙蒸餾水先后連續(xù)滴洗樣品銅網(wǎng)，吸除余液后以2%磷鎢酸（pH值6.8）負(fù)染色。

3.超薄切片電鏡觀(guān)察：取病葉退綠黃化邊緣部位切成2mm×4mm小片，用0.1mol/L

磷酸緩沖液配置的2.5%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定，乙醇梯度脫水，丙酮替代，Supper’

樹(shù)脂包埋，在德國(guó)LeicaUC7型超薄切片上用鉆石刀切成70nm厚的超薄切片，檸檬酸鉛

和醋酸雙氧鈾雙重染色。

上述樣品均在日立HitachiH-7650型透射電鏡下觀(guān)察，加速電壓為80kV，用美國(guó)Gatan

832型CCD相機(jī)記錄圖像。

4.觀(guān)察結(jié)果分析：

（1）田間癥狀：云南大田玉米新葉出現(xiàn)褪綠、黃綠色的癥狀，隨著病害的發(fā)展，葉片

上高密度的褪綠斑點(diǎn)非常顯著；成株期發(fā)病植株比正常植株矮小，生長(zhǎng)緩慢，節(jié)間短植株

明顯矮化，嚴(yán)重受害植株不能抽穗和結(jié)苞，大部分葉片枯萎。

圖1.大田玉米感染MCMV的發(fā)病狀況圖2.感染MCMV玉米病株葉片退綠癥狀

（2）負(fù)染色和免疫吸附電鏡觀(guān)察結(jié)果：感染MCMV的玉米病葉或種子研磨得到的粗

汁液經(jīng)負(fù)染色或免疫吸附后負(fù)染色，在透射電鏡下觀(guān)察到許多球狀病毒粒子，直徑約為30

nm左右，同時(shí)還能觀(guān)察到復(fù)合侵染的線(xiàn)狀病毒粒子。

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圖3.玉米病葉粗汁液中的MCMV粒子圖4.粗提純的MCMV粒子

（3）超薄切片電鏡觀(guān)察結(jié)果：在MCMV感染的病變細(xì)胞中可以觀(guān)察到大量球狀病毒

粒子分散在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，還有結(jié)晶狀排列的病毒聚集體；過(guò)氧化物酶體增生并聚集，形成周

邊復(fù)制小泡；線(xiàn)粒體呈現(xiàn)囊泡化病變，在由線(xiàn)粒體內(nèi)脊形變而成的囊泡結(jié)構(gòu)中積累了大量

纖維狀物質(zhì)，后期線(xiàn)粒體崩解。

圖5.玉米病葉細(xì)胞質(zhì)中散布的MCMV粒子圖6.細(xì)胞質(zhì)中的MCMV粒子形成結(jié)晶

圖7.過(guò)氧化物酶體聚集并形成周邊復(fù)制小泡；圖8.過(guò)氧化物酶體的周邊復(fù)制小泡

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圖9.細(xì)胞質(zhì)中的線(xiàn)粒體囊泡化病變圖10.細(xì)胞質(zhì)中