HPV檢測及臨床應(yīng)用

HPV檢測及臨床應(yīng)用婦產(chǎn)科研究室朱開春2019.8.27內(nèi)容目錄一、HPV病毒介紹二、HPV持續(xù)感染與宮頸病變?nèi)?、HPV檢測原理及主要檢測方法四、HPV檢測的臨床應(yīng)用新聞報道遼沈晚報2019.8.22人乳頭瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）屬于乳頭瘤病毒科，是一種DNA病毒。已分離出130多種，不同的型別引起不同的臨床表現(xiàn)，分為低危型和高危型。生物學(xué)活性：HPV抵抗力強，能耐受干燥并時間保持活性，加熱或經(jīng)福爾馬林處理可滅活。HPV檢查⒈醋白試驗；⒉組織學(xué)檢查；⒊分子生物學(xué)：PCR、核酸分子雜交技術(shù)等；⒋細胞學(xué)病理學(xué)檢查HPV感染途徑⒈性傳播途徑；⒉密切接觸；⒊間接接觸：通過接觸感染者的衣物、生活用品、用具等⒋醫(yī)源性感染：醫(yī)務(wù)人員在治療護理時防護不好，造成自身感染或通過醫(yī)務(wù)人員傳給患者；⒌母嬰傳播：是由嬰兒通過孕婦產(chǎn)道的密切接觸。

HPV基因組結(jié)構(gòu)與功能L1.免疫原性L2.免疫原性E1.復(fù)制E2.整合位點E4/5.病毒功能區(qū)E6.癌基因(p53)E7.癌基因(Rb)LCR.調(diào)節(jié)子LCRE6E7E1E2E4E5L2L1宿主

DNAL2宿主

DNAL1LCRE6E7E1E2被破壞和失活E2LCR=longcontrolregionAdaptedfromGoodmanAetal.NEnglJMed2003;349:1555-1564長控區(qū)域轉(zhuǎn)錄復(fù)制區(qū)域殼蛋白合成區(qū)域HPV分型小DNA病毒130多種亞型高危型、低危型HPV16、18HPV譜系和型內(nèi)變異株18453133353951525658596668HPV與子宮頸癌

HPV16和18型導(dǎo)致~70%宮頸癌型別%子宮頸癌分布57%16%7%4%3%<13%16HPV持續(xù)感染與宮頸病變連續(xù)兩次（間隔9-12個月）檢測HPV為陽性，視為持續(xù)性感染30歲以上者在第一次檢測陽性時，可看做是持續(xù)性感染，給予高度重視（dr.singer）HPV持續(xù)感染HPV感染可以表現(xiàn)為長期的隱性感染。而且大多數(shù)婦女會在感染HPV9-16個月后通過自身免疫把病毒清除掉。（男性數(shù)周）持續(xù)感染HPV高危型病毒是引致并維持高度病變的必要條件。三、HPV檢測原理主要檢測方法檢測的目標1.HPVDNAWholegenome、L1region2.mRNAE6、E7mRNA3.ProteinL1、E6、E7目前中國宮頸癌篩查檢測行業(yè)現(xiàn)狀技術(shù)種類繁多FDA/CE/CFDAHPV檢測技術(shù)雜交捕獲技術(shù)：HC2、careHPV、德同PCR+導(dǎo)流膜技術(shù)：凱普、亞能熒光PCR技術(shù)：羅氏CobasmRNA檢測技術(shù)：豪洛杰Aptima二代雜交捕獲技術(shù)----HPVDNA檢測HC2/careHPV檢測“全長雞尾酒”探針技術(shù)HPV16HPV18HPV31HPV33HPV35HPV39HPV45HPV51HPV52HPV56HPV58HPV59HPV68二代雜交捕獲技術(shù)原理：利用基因雜交、化學(xué)發(fā)光、信號放大的原理，在分子水平同時檢測被WHO確認的13/14種高危型HPV：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、66。不分型?！叭L雞尾酒”探針技術(shù)，涵蓋HPVDNA所有區(qū)域約8000bp堿基對由13/14種不同型別探針混合，一種探針針對一個HPV型別無需DAN提取，無需PCR擴增HPV66HPV病毒基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，含有~8000個堿基對。變性雜交

捕獲

雜交檢測

發(fā)光檢測全長RNA探針：8000bps—與HPVDNA等長HC2使用全長的RNA探針可以防止由于病毒變異或者L1基因段缺失導(dǎo)致的假陰性因此具有高的敏感性，且重復(fù)性好,適合用于宮頸癌的篩查。技術(shù)原理：先提取基因組DNA,進行PCR擴增，然后利用“導(dǎo)流雜交技術(shù)”通過儀器檢測HPVDNA.檢測出21型HPV，分型。包括15種高危型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68；6種低危型：HPV6,11,42,43,44，CP8304探針長度約150bp，僅基于L1片斷，非全長。（病毒L1基因有5-10%的缺失、突變，僅以L1基因片段設(shè)計探針，存在5-10%的漏診）僅1種通用探針，并非一個型別對應(yīng)一個探針PCR+導(dǎo)流雜交技術(shù)-----HPVDNA檢測PCR+導(dǎo)流膜雜交檢測技術(shù)“寡核苷酸探針”技術(shù)21種HR通用探針HPV病毒基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，含有~8000個堿基對。熒光定量PCR技術(shù)-----HPVDNA檢測Title,Location,Date18熒光PCR技術(shù)--CobasHPV“寡核苷酸探針”技術(shù)熒光PCR檢測，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行分析的方法。檢測出14型高危型HPV，12種高危不分型：HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、66；2種高危分型：HPV16、18探針長度約200bp，僅基于L1片斷，非全長。（病毒L1基因有5-10%的缺失、突變，僅以L1基因片段設(shè)計探針，存在5-10%的漏診）3種探針混合：12種高危型一個探針，HPV16、18型分別一個探針，HPV病毒基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，含有~8000個堿基對。HPV16HPV1812種HR通用探針cobasHPV熒光定量檢測通道1通道24531333935515256585966681618通道3通道4檢測HPV16檢測HPV18檢測β-globin內(nèi)質(zhì)控檢測12hrHPV12hrHPV指除HPV16/18型外的其他12種高危型HPVRocheMolecularSystems,Inc.全自動核酸提純及熒光PCR分析系統(tǒng)cobas4800system國械注進2015340014420mRNAE6/E7檢測技術(shù)-----AptimaHPVRNA檢測簡單來講，E6/7mRNA是致癌腫瘤蛋白產(chǎn)生過程的中間產(chǎn)物先有E6/E7DNA，再有mRNA，然后有蛋白，最后產(chǎn)生細胞學(xué)改變先后HPV病毒顆粒病毒DNA基因組活躍的病毒表達E6/E7mRNAE6/E7腫瘤蛋白導(dǎo)致癌變E6/E7mRNA在宮頸組織中表現(xiàn)癌基因活性E6/E7是HPV病毒的兩條癌基因片段，其表達導(dǎo)致宿主細胞惡性轉(zhuǎn)化E6/E7顯著介導(dǎo)誼癌基因p53和Rb的降解，從而干擾細胞周期調(diào)節(jié)HPVmRNA檢測——豪洛杰Cervista-HPV檢測AptimaTMHPV檢測是目前美國FDA最新并且是唯一批準的基于E6、E7mRNA的新一代HPV檢測產(chǎn)品。與傳統(tǒng)基于HPVDNA的試劑“查（毒）感染”相比，檢測E6/E7mRNA相比DNA的方法，更關(guān)注高級別病變（CIN2+）。AptimaHPV具有與HPVDNA檢測相似的臨床敏感性，和更好的特異性。減少了20-40%的一過性感染導(dǎo)致的假陽性，從而減少患者不必要的心理壓力和陰道鏡轉(zhuǎn)診。Aptima全球范圍內(nèi)被批準的適應(yīng)癥采用恒溫擴增技術(shù)

凱杰HC2HPVDNA二代雜交捕獲技術(shù)凱普HPVDNA芯片HPV21分型檢測

熒光定量PCRHPV16/18分型檢測面對如此多的篩查技術(shù)，應(yīng)該關(guān)注什么？25宮頸癌篩查應(yīng)該關(guān)注什么？準確性高檢測的HPV型別越多越好可以分型大規(guī)模臨床驗證臨床敏感度高，陰性預(yù)測值高權(quán)威指南推薦篩查HPV檢測篩查聯(lián)合細胞學(xué)篩查ASC-US分流對ASC-US患者進行分流，轉(zhuǎn)診陰道鏡術(shù)后隨訪宮頸病變治療后的隨訪與管理美國癌癥協(xié)會（AmericanCancerSociety,ACS）美國陰道鏡和宮頸病理學(xué)會（AmericanSocietyforColposcopyandCervicalPathology,ASCCP）美國臨床病理學(xué)會（AmericanSocietyforClinicalPathology,ASCP）歐洲下生殖道感染腫瘤學(xué)會（EUROGIN）四、HPV檢測的臨床應(yīng)用HPVDNA檢測用于宮頸癌篩查HPV檢測有更高的敏感度，能夠發(fā)現(xiàn)細胞學(xué)不能找到的病人。對高度病變有很好的預(yù)測性。能夠把篩查間隔安全地延長到3-5年HPV檢測可對ASCUS的婦女進行追蹤管理ASCUS發(fā)生率1.6-7.7%。約15-30%得高度病變來自ASCUS。約有78%ASCUS病人陰道檢查結(jié)果正常。ASCUS的婦女心理壓力并不低于結(jié)果為高度病變的婦女。對ASCUS病人的追蹤檢查費用耗資巨大。HPV檢測可作為治療后的追蹤手段

術(shù)后6及12月復(fù)查HPV1、評價病變是否殘留2、預(yù)測病變是否復(fù)發(fā)對治療后的病人為什么需要跟蹤？

治療后的病人都存在著一定的復(fù)發(fā)風(fēng)險。有研究指出，對45,000治療后的婦女追蹤、觀察，發(fā)現(xiàn)2116個在8年內(nèi)有復(fù)發(fā)病變治療后的病人復(fù)發(fā)風(fēng)險比正常人群中要高5倍。HPV