《基因測序與合成工藝技術(shù)要求》征求意見稿

1基因測序與合成工藝技術(shù)要求本文件規(guī)定了基因測序與合成工藝流程的總則、原理、樣本處理Sanger測序工藝流程、二代測序（NGS）工藝流程、基因合成工藝流程。本文件適用于對基因測序與合成工藝流程的指導(dǎo)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T27025-2019檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求GB/T30989-2014高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T37873-2019合成基因質(zhì)量評價(jià)通則GB/T40664-2021用于高通量測序的核酸類樣本質(zhì)量控制通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1細(xì)胞裂解Celllysis指將細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破裂以釋放其內(nèi)部成分的過程。3.2引物Primer在DNA復(fù)制過程中，結(jié)合于模板鏈上并作為復(fù)制延伸的起始位點(diǎn)和/或終止位點(diǎn)的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。[來源：GB/T30989-2014]3.3酶切Enzymecutting用特定的限制性內(nèi)切酶對DNA分子或載體分子在特定的位置進(jìn)行切割，以獲得特定的粘/平末端用于后續(xù)的連接反應(yīng)。3.4橋式PCRBridgepolymerasechainreaction2單鏈文庫DNA一端序列與芯片表面固定的寡核苷酸特異性結(jié)合，當(dāng)連接片段的另一端彎曲，與芯片表面固定的另一條互補(bǔ)寡核苷酸“形成橋”，以文庫DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)。3.5二代測序Next-generationsequencing區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger測序，能夠一次并行對大量核酸分子進(jìn)行平行序列測定的技術(shù)，通常一次測序反應(yīng)能產(chǎn)出不低于100Mb的測序數(shù)據(jù)。3.6接頭Adapter用于標(biāo)記和固定待測序片段的一小段已知序列的DNA片段。3.7基因測序Genesequencing對核酸分子的核苷酸排列順序的測定，即測定組成核酸分子的腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）或者是尿嘧啶（U）的排列順序。[來源：GB/T30989-2014]3.8基因Gene位于染色體上編碼一個特定功能產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或RNA分子）的一段核苷酸序列，是遺傳信息的基本單位。[來源：GB/T30989-2014]3.9合成基因Synthesizedgene用生物化學(xué)的方法，按照設(shè)定的核苷酸序列人工合成的雙鏈DNA。[來源：GB/T37873-2019]3.10文庫Library通過生物來源的、人工合成的或克隆技術(shù)所得到的一個重建分子群。例如基因組文庫、互補(bǔ)DNA文庫、噬菌體展示肽文庫等。[來源：GB/T43636]3.11寡核苷酸Oligonucleotide一類短鏈核苷酸的總稱，常用作探針確定DNA或RNA的序列。[來源：GB/T30989-2014]34縮略語下列縮略詞適用于本文件。ddNTP雙脫氧核苷核苷三磷酸（DoubleDeoxy-ribonucleosideTriphosphate）DNA脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTP脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosideTriphosphate）HPLC高效液相色譜儀（HighPerformanceLiquidChromatography）NGS二代測序（NextGenerationSequencing）OPC寡核苷酸純化柱（OligonucleotidePurificationCartridge）PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）RNA核糖核酸（RibonucleicAcid）5總則5.1Sanger測序首先利用測序樣品通過測序PCR反應(yīng)獲得待測序產(chǎn)物，然后對待測序產(chǎn)物進(jìn)行純化與變性后，將變性產(chǎn)物上樣至基因測序儀中電泳，獲得電泳圖譜，經(jīng)基因測序儀配套的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對圖譜進(jìn)行分析后，獲得所測序列信息，并形成堿基序列輸出。5.2二代測序5.2.1形成測序文庫：將生物樣本處理形成待測樣品，對待測序的核酸片段兩端連上接頭，通過測序擴(kuò)增反應(yīng)，形成測序核酸樣品的測序文庫。5.2.2進(jìn)行測序反應(yīng)，同步收集測序信號：加入底物核苷酸，在測序酶的作用下使底物核苷酸與測序文庫中的待測樣品進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)收集該過程中產(chǎn)生的信號，包括但不限于熒光信號、電信號或離子信號。5.2.3測序信號分析：對得到的測序信號進(jìn)行處理分析，將信號圖轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账釅A基序列信息。5.3基因合成合成基因的DNA序列，在符合國際基因合成聯(lián)盟（IGSC）生物安全要求條件下，其質(zhì)量要求，包括DNA純度、總量、完整性與序列一致性。合成的基因應(yīng)符合GB/T37873-2019的質(zhì)量評價(jià)要求。5.4實(shí)驗(yàn)人員操作要求實(shí)驗(yàn)室的人員應(yīng)按照GB/T27025-2019的要求，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。5.5儀器設(shè)備要求各實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域的物品混用。儀器設(shè)備的校準(zhǔn)應(yīng)符合GB/T27025-2019的規(guī)定，主要儀器設(shè)備參見附錄A。5.6其他要求所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級應(yīng)為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的選購、驗(yàn)收、貯存應(yīng)符合GB/T27025-2019規(guī)定。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-2008中一級水的規(guī)格。去離子水的電阻應(yīng)達(dá)到18.2mΩ。商品試劑盒應(yīng)注明到貨日期，對所收到的試劑盒應(yīng)按規(guī)定的貯存條件存放，主要試劑及溶液參見附錄B。46原理6.1堿基互補(bǔ)配對原理在DNA分子結(jié)構(gòu)中，堿基之間的氫鍵具有固定的數(shù)目，且DNA兩條鏈之間的距離保持不變。DNA分子結(jié)構(gòu)的4種堿基之間的配對遵循一定的規(guī)律，即A僅與T配對，G僅與C配對，反之亦然。腺嘌呤與胸腺嘧啶之間有兩個氫鍵，鳥嘌呤與胞嘧啶之間有三個氫鍵，即A=T、G≡C。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，一條鏈上的A的數(shù)量等于互補(bǔ)鏈上的T的數(shù)量；一條鏈上的G的數(shù)量等于互補(bǔ)鏈上的C的數(shù)量，反之亦然。6.2亞磷酰胺三酯法原理亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。具體流程見附錄C.1。6.3Sanger法測序原理每一輪序列測定由一套四個單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有的四種dNTP，并混入少量一種ddNTP。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3′-OH基團(tuán)，在DNA合成反應(yīng)中不能形成磷酸二酯鍵，用來中端DNA合成反應(yīng)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例的帶有熒光同位素標(biāo)記的某種ddNTP，通過凝膠電泳和放射自顯影，就可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。具體流程見附錄C.2。6.4一代測序儀在強(qiáng)電場的作用下，熒光標(biāo)記的DNA片段通過毛細(xì)管中的高分子聚合物從負(fù)極向正極移動；片段越短，移動速度越快，長度不同的DNA片段依次通過檢測窗口；熒光分子在檢測窗口被激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號，熒光信號被CCD相機(jī)掃描，傳遞給計(jì)算機(jī)測序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)收集軟件并轉(zhuǎn)換成原始數(shù)據(jù)信號，分析軟件分析原始數(shù)據(jù)信號呈現(xiàn)出最終的測序峰圖。6.5邊合成邊測序原理將生物樣本制備成待測樣品，通過橋式PCR擴(kuò)增技術(shù)，將待測樣品量放大，并收集成文庫，然后進(jìn)行平行循環(huán)測序。利用邊合成邊測序的策略，加入一種或多種帶標(biāo)記的底物核苷酸，在聚合酶的作用下，按照堿基互補(bǔ)配對原則，進(jìn)行DNA鏈的延伸，延伸一輪測取一輪底物與模板結(jié)合后發(fā)出的熒光信號，收集該信號并確定所測位點(diǎn)的堿基信息；當(dāng)上輪測序完成后，利用可逆技術(shù)，繼續(xù)進(jìn)行下一輪反應(yīng)，重復(fù)測序過程，即可實(shí)現(xiàn)高通量基因測序。7樣本處理7.1樣本提取7.1.1樣本前處理根據(jù)不同生物樣本選擇的不同處理方式，動植物組織使用液氮研磨；哺乳動物血液樣本使用紅細(xì)胞裂解液對紅細(xì)胞去除；細(xì)胞樣本/貼壁細(xì)胞經(jīng)胰酶消化處理再做收集；細(xì)菌樣本溶菌酶破壁處理；真菌樣本經(jīng)酶解破壁或液氮凍融或超聲裂解；FFPE樣本使用二甲苯或礦物油類的物質(zhì)進(jìn)行脫蠟處理方式。7.1.2樣本裂解5根據(jù)生物樣本的不同，參照附錄D.1和附錄D.2方法進(jìn)行裂解。7.1.3核酸分離純化根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體情況，選擇附錄D.3和附錄D.4方法進(jìn)行DNA和RNA的分離純化。7.2樣本質(zhì)量檢測評估對常規(guī)樣本的核酸提取純化方法的一般性評價(jià)，具體見GB∕T37874-2019和GB∕T40664-2021。8Sanger測序工藝流程8.1核酸提取及質(zhì)量評估具體見第7章樣本處理。8.2引物設(shè)計(jì)使用引物設(shè)計(jì)軟件根據(jù)待測基因序列設(shè)計(jì)所需的引物。引物長度一般在17bp~25bp；G+C含量在40%~60%之間，45%~55%最佳；引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值在55℃~80℃之間，最好為72℃左右；引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾，且3'端的堿基一般不用A；堿基隨機(jī)分布，盡量均勻，不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。8.3測序PCR模板擴(kuò)增在模板中加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP，通過PCR儀的溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，完成特定基因的體外擴(kuò)增，得到充足的模板。8.4PCR產(chǎn)物純化去除PCR反應(yīng)液殘留的引物、dNTPs、鹽成分、非特異PCR產(chǎn)物等，以防止后期測序PCR反應(yīng)中出現(xiàn)多重測序，抑制測序酶活性，擴(kuò)增出同源性區(qū)域。8.5測序PCR反應(yīng)使用Sanger測序試劑盒，加入PCR產(chǎn)物及引物進(jìn)行測序PCR反應(yīng)。8.6測序反應(yīng)產(chǎn)物純化對測序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，過濾混合物，去除ddNTP等其他雜質(zhì)，只留下長短不一的目的PCR片段。8.7上機(jī)測序制備凝膠后，對一代測序儀儀器通道排除氣泡后，開始測序，通過激光照射，讀取熒光基團(tuán)，得到一代測序結(jié)果。9二代測序工藝流程9.1樣本制備和質(zhì)量評估樣本制備和質(zhì)量評估按照第7章樣本處理要求執(zhí)行。69.2構(gòu)建文庫文庫制備對于成功進(jìn)行二代測序工作流程至關(guān)重要。該步驟會制備出兼容測序儀的DNA樣本。本流程包括常用的DNA建庫和mRNA建庫流程，具體建庫流程圖參見附錄C.3、C.4、C.5。9.2.1DNA文庫構(gòu)建一般規(guī)定根據(jù)待測目的基因性質(zhì)，特定基因需設(shè)計(jì)所需的引物（見8.2），再經(jīng)過目的片段DNA的擴(kuò)增（見8.3），獲得足夠濃度和純度的目標(biāo)DNA片段；非特定基因按9.1的要求獲得足夠濃度和純度的DNA。DNA文庫使用建庫試劑盒構(gòu)建。片段化將目標(biāo)DNA片段使用限制性內(nèi)切酶或超聲波打斷進(jìn)行片段化處理。末端修復(fù)將隨機(jī)打斷、末端不平的片段化DNA通過末端修復(fù)酶進(jìn)行末端補(bǔ)齊和5’端磷酸修飾。添加接頭經(jīng)過末端修飾后的DNA片段3'末端具有突出的A尾，而接頭具有突出的T尾，使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端，形成“Y”形接頭。PCR擴(kuò)增純化添加了接頭的DNA片段，可通過與接頭互補(bǔ)的引物來擴(kuò)增，富集文庫，再通過磁珠法對文庫純化，以去除雜質(zhì)和未連接的接頭或接頭二聚體。9.2.2常規(guī)mRNA文庫構(gòu)建不論真核生物還是原核生物，其RNA中最多的是rRNA，其占比高達(dá)80%。如果直接對樣本的總RNA進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)中絕大部分將為rRNA的相關(guān)數(shù)據(jù)，因此通過RNA富集的方法去除rRNA，得到純化的mRNA。然后再進(jìn)行文庫構(gòu)建。mRNA純化.1poly(A)純化：真核生物的mRNA的3'端具有poly(A)尾結(jié)構(gòu)，用帶有Poly(T)探針的磁珠與總RNA進(jìn)行雜交。然后Poly(T)探針就和帶Poly(A)尾巴的mRNA結(jié)合在一起，通過回收磁珠，去除其他RNA，見附錄C.4。.2去除rRNA：通過使用與rRNA互補(bǔ)的寡核苷酸探針與總RNA樣品雜交去除16S和23SrRNA，見附錄C.5。片段化處理將含有金屬離子（Mg2+、Zn2+）的打斷buffer，對RNA進(jìn)行打斷。根據(jù)需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時(shí)間。合成cDNA被打斷的這些mRNA片段，通過隨機(jī)六聚體引物，逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模版合成cDNA。7合成雙鏈DNA加入dNTP、聚合酶以cDNA為模板在PCR儀中進(jìn)行雙鏈DNA合成，并加入RNaseH、磷酸化酶、外切酶將雙鏈DNA末端補(bǔ)齊以及對雙鏈DNA的5’端進(jìn)行磷酸修飾和3’末端突出的A尾修飾。添加接頭通過T4DNA連接酶和含有高濃度鹽離子及PEG的連接buffer，在雙鏈的cDNA的兩端接上“Y”型的接頭（每個接頭都有一個index，不同的文庫構(gòu)建可以使用不同的index）。片段選擇利用磁珠對產(chǎn)物進(jìn)行純化與分選，去除雜質(zhì)及接頭二聚體，獲得所需大小的目的片段。PCR擴(kuò)增、純化針對核酸樣本建庫的不同起始量，選擇合適的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增來富集文庫。9.3文庫質(zhì)檢對建好的文庫進(jìn)行文庫濃度的定量和文庫質(zhì)量評價(jià)，良好的文庫應(yīng)有足夠的濃度并在預(yù)計(jì)大小的位置有一個較窄的峰，而其他位置無峰。9.4上機(jī)測序根據(jù)數(shù)據(jù)量及文庫片段長度，采用多重分析法，將多個文庫混合并在定量后進(jìn)行變性處理。單鏈化的文庫DNA片段通過二代測序儀進(jìn)行邊合成邊測序得到測序數(shù)據(jù)。測序儀中的具體流程見附錄E。10基因合成工藝流程本標(biāo)準(zhǔn)所述基因合成的內(nèi)容主要包含引物合成（短片段）和基因合成（長片段）的合成。具體流程圖見附錄C.6和附錄C.7。10.1引物合成10.1.1單體溶解取有效期內(nèi)的A、T、C、G四種單體試劑，加入乙腈溶解固體粉末，待單體全部溶解，除氣泡后備用。10.1.2寡核苷酸（Oligo）片段合成根據(jù)目的寡核苷酸片段序列，在合成儀上合成特定的寡核苷酸（Oligo）片段，一般引物長度在20個堿基左右，最長一般不超過60個堿基，具體流程見附錄F。10.1.3切割和脫保護(hù)基切割將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學(xué)切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG上連接化合物與初始核苷間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3'羥基，可以參與生化反應(yīng)。脫保護(hù)基8胸腺嘧啶不需要保護(hù)基團(tuán)，但腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤需要，因?yàn)樗鼈兒协h(huán)外伯氨基。必須除去保護(hù)基團(tuán)，以便可以形成寡核苷酸與靶核酸之間的適當(dāng)氫鍵。須在此步前選好后續(xù)的純化方法。用新鮮的濃氨水處理較長時(shí)間以脫掉腈乙基、苯甲酰基、異丙基，用三氟乙酸脫5'-DMT。10.1.4純化/分裝通過DSL、OPC、PAGE、HPLC等方式純化引物，測定OD260定量，根據(jù)要求干燥/分裝。通常寡核甘酸的穩(wěn)定性很好，-20℃可穩(wěn)定保存一年以上。針對不同的需求，可選擇不同的純化方式，不同純化方式的選擇依據(jù)見附錄G。10.2基因合成10.2.1序列分析和優(yōu)化分析訂單方案與基因序列，以及方案目標(biāo)與序列結(jié)構(gòu)、GC含量特征，制定合適的構(gòu)建方案并設(shè)計(jì)10.2.2引物合成根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物序列，使用Oligo化學(xué)合成的方式，合成帶有重疊區(qū)域的40~200nt的小片段引物，并進(jìn)行后續(xù)的氨解、純化，并對引物質(zhì)量進(jìn)行檢測（見10.1）。10.2.3寡核苷酸拼接使用重疊PCR的技術(shù)，將單鏈的引物拼裝成雙鏈的基因片段，對于3Kb以內(nèi)的且無復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的基因，可直接進(jìn)入全長組裝；如果基因全長超過3Kb，則需要進(jìn)行分片段組裝。10.2.4連接轉(zhuǎn)化將獲取的目的基因連接到克隆載體（載體pUC57）或客戶指定的目的載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)胞與連接產(chǎn)物和LB培養(yǎng)基混合，并在37℃搖床上以200rpm恢復(fù)，均勻涂布在具有相應(yīng)抗性或其他篩選平板上，37°C下過夜培養(yǎng)菌落。10.2.5陽性克隆篩選與測序?qū)⑻羧〉年栃钥寺尉鋽U(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行一代測序，測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全匹配，即表明基因序列符合要求。10.2.6酶切質(zhì)檢將測序正確的質(zhì)粒提交質(zhì)檢部門，用于酶切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為雙條帶，并且條帶大小與載體、目的片段大小一致，即表明質(zhì)粒形態(tài)、大小符合要求。10.2.7成品將測序正確、酶切質(zhì)檢正確的高純度凍干質(zhì)粒，含有重組質(zhì)粒的穿刺菌或甘油菌以及報(bào)告（含測序結(jié)果、COA報(bào)告、SQD文件、SEQ文件等）。9附錄A（資料性）主要儀器設(shè)備A.1離心機(jī)實(shí)驗(yàn)室通用離心機(jī)，應(yīng)符合YY/T0657-2008的要求。A.2低溫離心機(jī)應(yīng)符合YY/T0657-2008的要求。A.3PCR儀應(yīng)符合YY/T1173-2010的要求。A.4紫外分光光度計(jì)應(yīng)符合JB/T6777的要求。A.5電泳裝置應(yīng)符合YY/T0087-2004的要求。A.6通風(fēng)櫥應(yīng)符合YY0569的要求。A.7引物合成儀A.8引物純化儀A.9電泳凝膠成像系統(tǒng)A.10一代測序儀A.11可調(diào)移液器應(yīng)符合JJG646的要求。A.12二代測序儀行業(yè)內(nèi)不同的二代測序儀采用不同的大規(guī)模擴(kuò)增方法，較為常見的有EPCR擴(kuò)增、橋式PCR擴(kuò)增，可根據(jù)具體的擴(kuò)增方法選擇符合國家或行業(yè)內(nèi)現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)的大規(guī)模擴(kuò)增儀器設(shè)備。二代測序技術(shù)中，基因測序儀應(yīng)至少達(dá)到下表的要求：序號基本參數(shù)說明1測序通量≥100Mbp2堿基識別質(zhì)量>203測序準(zhǔn)確率Q值過濾之后的準(zhǔn)確率≥99.9%4Fluidcell升降溫速度室溫25℃條件下，F(xiàn)luidcell溫度從25℃升到65℃的時(shí)間≤50s室溫25℃條件下，F(xiàn)luidcell溫度從65℃升到25℃的時(shí)間≤250s主要試劑及溶液B.1CTAB裂解液Tris-HCl(PH8.0)提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相中。B.2Trizol溶液異硫氰酸/硫氰酸胍(GITC)：屬于解偶劑，將RNA釋放到溶液中。酚和8-羥基喹啉；β-巰基乙醇：主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。B.3DNA提取試劑盒用于從生物樣本中提取待測樣本，進(jìn)行Sanger測序或者二代測序，試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含：細(xì)胞裂解液、洗脫液、TEbuffer。B.4Sanger測序試劑盒用于對待測序樣本進(jìn)行上機(jī)前的擴(kuò)增，得到差一個堿基的多條擴(kuò)增產(chǎn)物。試劑盒應(yīng)至少包含：測序酶、dNTPs、熒光標(biāo)記的ddNTPs、Buffer。B.5建庫試劑盒用于核酸樣品的基因文庫構(gòu)建，試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含：接頭、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、緩沖B.6二代測序試劑盒用于對測序文庫進(jìn)行高通量基因測序，試劑盒應(yīng)至少包含測序引物、測序酶、緩沖液。B.7基因合成涉及試劑三氯乙酸C2HCl3O2Trichloroaceticacid（TCA）亞磷酰胺C52H62N3O7P四氮唑CH2N4Tetrazole乙酸酐C4H6O3Aceticanhydride碘I2Iodine氨水NH3·H2Oaqueousammonia含氨25%～28%的水溶液乙腈C2H3NAcetonitrile（資料性）工藝流程示意圖C.1亞磷酰胺三酯合成法示意圖C.2Sanger測序工藝流程C.3傳統(tǒng)DNA建庫工藝流程C.4基于oligo-dT富集的mRNA建庫流程C.5基于酶法的rRNA去除的mRNA建庫流程C.6引物合成工藝流程示意圖C.7基因合成工藝流程示意圖附錄D（資料性）主要實(shí)驗(yàn)方法D.1基因組DNA裂解D.1.1CTAB法CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子去污劑，可以溶解細(xì)胞膜，與核酸結(jié)合形成在高鹽環(huán)境下可溶的復(fù)合物。D.1.2SDS法SDS法（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去垢劑，高溫（55-60℃)裂解細(xì)胞，蛋白變性，染色體離析，在高鹽環(huán)境下或降低溫度后蛋白、多糖等結(jié)合形成的復(fù)合物沉淀，釋放核酸。D.2質(zhì)粒DNA裂解D.2.1堿裂解-SDS法在氫氧化鈉（PH12-12.6堿性環(huán)境）和去污劑SDS的作用下細(xì)胞破裂，細(xì)菌蛋白質(zhì)和染色體DNA變性，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA變性。加入酸性高鹽緩沖液后PH恢復(fù)中性，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性速度快于線性的染色體DNA。細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物被SDS包蓋。之后復(fù)合物沉淀下來，質(zhì)粒DNA留在上清中。D.2.2煮沸法含有TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中加熱至100℃使細(xì)菌裂解。通過加熱破壞細(xì)菌外壁的同時(shí)有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。溫度下降后，閉環(huán)DNA形成超螺旋分子，離心時(shí)留在上清中。D.3DNA分離純化D.3.1酚氯仿抽提法該方法包括兩個步驟：1）利用酚氯仿對裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)DNA與蛋白質(zhì)的分離；2）再用醇將DNA沉淀下來，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。D.3.2離心柱法獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。D.3.3磁珠法將純化介質(zhì)包被在納米級的磁珠表面，通過介質(zhì)對DNA的吸附，在外加磁場的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動，從而達(dá)到核酸與其它物質(zhì)分離的目的。D.4RNA提取Trizol溶液使蛋白質(zhì)和RNase變性并分離，釋放RNA至溶液中。加入氯仿后進(jìn)行離心，樣品分層為無色的水樣層和黃色的有機(jī)層，在酸性條件下總RNA保留在上層水相中。大部分DNA和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機(jī)相。收集上述水樣層，通過異丙醇沉淀回收RNA。二代測序儀測序步驟E.1吸附和互補(bǔ)鏈合成制備好的單鏈DNA文庫P5序列與Flowcell的P5'互補(bǔ)，吸附在芯片上。以寡核苷酸為引物、文庫片段為模板，在DNA聚合酶的作用下，從雜交點(diǎn)的3'端到5'端延伸合成互補(bǔ)鏈，形成雙鏈DNA。解鏈后原始文庫中的DNA鏈，留下新合成的單鏈DNA。E.2“橋”式擴(kuò)增單鏈DNA另一端的接頭序列與相鄰的另一種寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)行“橋”式擴(kuò)增，形成DNA簇，通過特定的酶切除與flowcell上P7序列不結(jié)合的DNA鏈（即反鏈），只保留與P7結(jié)合的DNA鏈。E.3Reads讀取流通池中加入測序引物、DNA聚合酶、不同顏色的可逆終止熒光基團(tuán)dNTP。一個循環(huán)延長一個堿基，洗脫游離的dNTP，激光掃描判斷堿基種類。一個循環(huán)結(jié)束后加入化學(xué)試劑將疊氮基團(tuán)和標(biāo)記的熒光基團(tuán)切掉，再加入新的dNTP和聚合酶進(jìn)入下一個堿基的測序反應(yīng)。Read讀取完成，洗去前面的產(chǎn)物，加入index的測序引物，讀取每個樣本特定的index(又稱barcode)，用于標(biāo)記樣本來源。寡核苷酸（oligo）片段合成步驟F.1脫保護(hù)將預(yù)先連接在固相載體可控孔度玻璃（CPG）上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸（TCA）反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)二甲氧基三苯甲基（DMT），獲得游離的5'-羥基；F.2耦連合成DNA的原料—亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，其3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，亞磷酰胺四唑活性中間體與CPG上核苷酸的游離5'-羥基發(fā)生親和反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈延長一個堿基。F.3蓋帽縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)（少于2%)，如果沒有被封閉，這些羥基基團(tuán)將在下一個循環(huán)中反應(yīng)，從而導(dǎo)致缺失堿基。因此用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。F.4氧化由于亞磷酸三酯不穩(wěn)定，在水和吡啶存在下用碘實(shí)現(xiàn)亞磷酸三酯的氧化，生成磷酸三酯。F.5循環(huán)經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以TCA脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。（資料性）引物純化方式針對不同的需求，選擇不同的純化方式。如下表所示：表G.1引物不同用途不同純化方式選擇應(yīng)用方向純化方式及純度DSLOPCPAGEHPLC純化效率>75%>95%>95%>99%普通PCR/RT-PCR√√√√熒光定量PCR√√√全基因合成√√√一代測序（sanger)√√√√點(diǎn)突變及載體構(gòu)建√√分子診斷PCR類√√飛行質(zhì)譜引物√N(yùn)GS接頭√√N(yùn)GS捕獲探針√√√擴(kuò)增子及引物池√√√√G.1DSL純化DSL純化，又稱為脫鹽純化或簡易反相柱純化，是通過高純氨氣水蒸汽混合物的氣相氨解環(huán)境，將連接在CPG（ControlledPoreGlass，控制孔徑玻璃）上的引物切割洗脫下來，同時(shí)有效地去除鹽分。DSL純化適用于大多