第十單元　第61課時(shí)　基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高中生物大一輪復(fù)習(xí)

第61課時(shí)基因工程的基本工具和基本操作程序課標(biāo)要求1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序?？记榉治?.基因工程的基本工具2023·新課標(biāo)·T62021·全國乙·T382021·湖北·T72.基因工程的基本操作程序2023·全國乙·T382023·全國甲·T382023·湖北·T42023·廣東·T202021·廣東·T22考點(diǎn)一基因工程的基本工具1．基因工程的概念2．基因工程的誕生和發(fā)展(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明了DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間________。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和______________的證明。(3)中心法則的確立。(4)______________的破譯。(5)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。______________________________的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。(6)________體外重組的實(shí)現(xiàn)。(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。(8)DNA測(cè)序和合成技術(shù)的發(fā)明。(9)________技術(shù)的發(fā)明。(10)________________技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。3．重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(簡稱“限制酶”)提醒①限制酶的識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。③在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。(2)DNA連接酶(3)載體(1)基因工程是人工操作導(dǎo)致的染色體變異，變異是不定向的()(2)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA()(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶()(4)質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為標(biāo)記基因()將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的過程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個(gè)操作步驟。實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)。請(qǐng)思考以下問題：(1)請(qǐng)用圖示法寫出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的過程。____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類限制酶？請(qǐng)說明理由。____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________歸納總結(jié)限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無效篩選)。(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端?？枷蛞槐嫖龌蚬こ痰幕竟ぞ?．(2021·湖北，7)限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ識(shí)別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對(duì))約為()A．6B．250C．4000D．240002．(2024·連云港高三調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標(biāo)記基因(如圖所示)，通過標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點(diǎn)。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況不同。如表是外源基因插入(插入點(diǎn)有a、b、c)后細(xì)菌的生長情況。下列有關(guān)敘述正確的是()項(xiàng)目細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長情況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長情況①能生長不能生長②能生長能生長③不能生長能生長A.質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)B．①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是a，②是c，③是bC．質(zhì)粒被一種限制酶切開時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)D．將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA聚合酶歸納提升與DNA有關(guān)的幾種酶的比較考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞________或獲得預(yù)期______________等的基因。(2)篩選合適的目的基因①從相關(guān)的已知__________________的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用________________和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。(3)目的基因的獲取①人工合成目的基因。②PCR__________和擴(kuò)增目的基因a．PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)________________________的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種__________與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行__________的技術(shù)。b．PCR反應(yīng)的條件：一定的______________、DNA模板、2種________、4種__________________、____________DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控________的儀器。c．PCR擴(kuò)增的過程d．PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用____________________來鑒定。歸納提升PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較③通過構(gòu)建______________來獲取目的基因。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因______________________________________，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用(3)構(gòu)建過程提醒啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)(正常情況下，不編碼氨基酸)3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物動(dòng)物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、________________________________________________________________________顯微注射法__________處理法受體細(xì)胞原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入辨析(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。4．目的基因的檢測(cè)與鑒定(1)目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因()(2)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋()(3)基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和終止子決定著翻譯的開始與結(jié)束()(4)Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起()(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體()(6)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原—抗體雜交技術(shù)()1．Bt抗蟲蛋白基因(簡稱Bt基因)是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行大量擴(kuò)增。回答下列問題：(1)什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(2)PCR擴(kuò)增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(3)為檢測(cè)Bt基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄，科研人員提取棉花細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Bt基因的cDNA，原因是什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(4)PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律如圖所示，若一個(gè)Bt毒蛋白基因在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上得到多少個(gè)DNA分子？含引物的DNA分子多少個(gè)？含其中一種引物的DNA分子多少個(gè)？同時(shí)含兩種引物的DNA分子多少個(gè)？共需要消耗多少個(gè)引物？含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(5)PCR擴(kuò)增Bt基因的過程中需要解旋酶嗎？并說明理由。所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________2．據(jù)圖分析抗蟲棉的培育過程。(1)該過程中的目的基因是________________，載體是__________。(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(3)為了保證目的基因在受體細(xì)胞中能正確表達(dá)，對(duì)目的基因在質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)有什么要求？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(4)該實(shí)例中，導(dǎo)入目的基因的方法是______________。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(6)該實(shí)例中，檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)的常見方法有哪些？________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________考向二辨析基因工程的基本操作程序3．(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落4．(2024·江蘇揚(yáng)州中學(xué)高三模擬)土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，下列相關(guān)敘述正確的是()A．目的基因應(yīng)插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNAB．用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細(xì)胞C．Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，沒有雙螺旋結(jié)構(gòu)D．可以用PCR技術(shù)檢測(cè)外源DNA是否整合到植物的染色體DNA上1.(選擇性必修3P67)基因工程：按照人們的愿望，通過______________等技術(shù)，賦予生物新的______________，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的______________________。2．(選擇性必修3P71)限制酶能夠識(shí)別________________________________，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。3．(選擇性必修3P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于________________________。4．(選擇性必修3P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供________________、________________、4種________________和耐高溫的________________。5．(選擇性必修3P77)真核細(xì)胞和細(xì)菌的____________________都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段______________________________________，引物的作用是__________________________________________。6．(選擇性必修3P80)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的：使目的基因_________________________，同時(shí)，使目的基因能夠________________________?；虮磉_(dá)載體是載體的一種，除目的基因、________________外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子等。啟動(dòng)子是__________________識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因____________________，最終表達(dá)出人類需要的____________。7．(選擇性必修3P81)轉(zhuǎn)化：____________________________