第三章 DNA復(fù)制 課件

第三章DNA復(fù)制

(DNAReplication)第三章-1DNA復(fù)制圖第一節(jié)基本概念

第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

第三節(jié)原核生物DNA復(fù)制（E.coli）

第四節(jié)真核生物DNA復(fù)制第五節(jié)DNA的損傷修復(fù)及突變第三章-1DNA復(fù)制圖DNA復(fù)制在細(xì)胞周期的S期第三章-1DNA復(fù)制圖一、DNA的半保留復(fù)制（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl設(shè)計(jì)的CsCl超離心試驗(yàn)證實(shí)了

DNA復(fù)制的這一特性（P39）第一節(jié)基本概念第三章-1DNA復(fù)制圖15N標(biāo)記實(shí)驗(yàn)·細(xì)胞生長(zhǎng)在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中·轉(zhuǎn)入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標(biāo)記DNA未標(biāo)記DNACsCL密度梯度離心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖ReplicationforkP40第三章-1DNA復(fù)制圖1、復(fù)制起點(diǎn)：富含AT&發(fā)夾結(jié)構(gòu)“呼吸作用”十分明顯許多酶的結(jié)合位點(diǎn)ATrich第三章-1DNA復(fù)制圖復(fù)制叉（replicationfork）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)

2、復(fù)制方向（復(fù)制過程的順序性）

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛第三章-1DNA復(fù)制圖真核生物的多復(fù)制子多個(gè)復(fù)制眼第三章-1DNA復(fù)制圖單、雙向復(fù)制取決于起點(diǎn)處有一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉

單向復(fù)制

雙向復(fù)制第三章-1DNA復(fù)制圖

復(fù)制的多模式單起點(diǎn)、單方向（原核）多起點(diǎn)、單方向（真核）單起點(diǎn)、雙方向（原核）多起點(diǎn)、雙方向（真核）第三章-1DNA復(fù)制圖

（1）θ復(fù)制：DNA在復(fù)制原點(diǎn)解開成單鏈，分別作為模板，各自合成互補(bǔ)鏈，出現(xiàn)2個(gè)叉狀的生長(zhǎng)點(diǎn)第三章-1DNA復(fù)制圖（2）共價(jià)延伸方式（covalenceelongation）或滾環(huán)式復(fù)制（rollingcirclereplication）由于復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，又稱σ復(fù)制

病毒、細(xì)菌因子

第三章-1DNA復(fù)制圖

（3）置換式（Displacementform

）又稱D環(huán)復(fù)制

動(dòng)物線粒體

DNA的復(fù)制方式第三章-1DNA復(fù)制圖第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶(P47)第三章-1DNA復(fù)制圖

其中DNApolⅢ

全酶有十種共22個(gè)亞基β二聚體－－滑動(dòng)鉗第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能（P47）1、DNA聚合酶活性：兩者都有條件－－模板、引物

DNApolⅠ－－主要用于DNA

的修復(fù)和RNA引物的替換能填充很大的缺口，甚至整個(gè)互補(bǔ)鏈

DNApolⅢ－－DNA鏈的延長(zhǎng)填充幾個(gè)堿基的小缺口

第三章-1DNA復(fù)制圖2、3’－5’外切核酸酶活性

校對(duì)功能(proofreading)第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖

3、5’－3’外切核酸酶活性

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三個(gè)特點(diǎn)：

?必須有5’－磷酸末端?被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對(duì)的?被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（缺口平移）第三章-1DNA復(fù)制圖缺口平移(nicktranslation)指在DNA分子的單鏈缺口上，DNAPolI的5’--->3‘核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5，端移去一個(gè)核苷酸之后，聚合作用就會(huì)在缺口的3，端補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但由于DNAPolI不能在3，-OH和5，-P之間形成一個(gè)鍵，因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行，5，端核苷酸不斷地被移去，3，端核苷酸又按序增補(bǔ)，于是缺口便沿著DNA分子合成方向移動(dòng)。

第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖DNA復(fù)制保持準(zhǔn)確性的機(jī)制:1、堿基互補(bǔ)配對(duì)2、復(fù)制酶的校對(duì)機(jī)制3、復(fù)制的起始具有引物：避免由于最初幾個(gè)核苷酸的復(fù)制錯(cuò)誤導(dǎo)致的致死突變!!!4、從5’到3’延伸5、生物體的DNA修復(fù)機(jī)制第三章-1DNA復(fù)制圖第三節(jié)原核生物DNA復(fù)制第三章-1DNA復(fù)制圖DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶既能水解，又能打斷堿基互補(bǔ)配對(duì)的氫鍵拓?fù)涿涪袂袛郉NA雙鏈中的一股拓?fù)涿涪蚯袛郉NA雙鏈

解鏈酶利用ATP解開DNA雙鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）維持模板處于單鏈狀態(tài)保護(hù)單鏈的完整引物酶是RNA聚合酶，合成一段RNA引物

第三章-1DNA復(fù)制圖

拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負(fù)超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負(fù)超螺旋時(shí)需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖幾乎所有天然狀態(tài)的雙鏈DNA均以負(fù)超螺旋的方式存在，許多實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)超螺旋是DNA復(fù)制的必需條件，因此DNA旋轉(zhuǎn)酶（原核生物）也是復(fù)制所必要的，負(fù)超螺旋的存在有利于DNA的雙鏈分開。第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖復(fù)制的引發(fā)(P46)前導(dǎo)鏈的引發(fā)：RNA聚合酶滯后鏈的引發(fā)：引發(fā)前體＋引發(fā)酶＝引發(fā)體第三章-1DNA復(fù)制圖引發(fā)體(primosome):

是由DnaA、DnaB、DnaC以及其他復(fù)制因子一起形成復(fù)合體，再結(jié)合引物酶（DnaG）形成較大的聚合體，結(jié)合到模板DNA上。第三章-1DNA復(fù)制圖引物酶(primase):

依賴DNA的RNA聚合酶

催化RNA引物的合成

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物RNA引物：在DNA模板的復(fù)制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA

聚合提供3′-OH末端。第三章-1DNA復(fù)制圖實(shí)際上，兩種類型的引物合成是在不同的DNA分子狀態(tài)下進(jìn)行的。前導(dǎo)鏈的引物合成需要引發(fā)DNA雙鏈；而滯后鏈的引物合成是在已經(jīng)解鏈的狀態(tài)下進(jìn)行的?？赡茉诖蠖鄶?shù)情況下，兩種類型的引物合成都是由引物酶合成的，RNA聚合酶的作用是通過轉(zhuǎn)錄解開局部DNA雙螺旋。第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖一個(gè)復(fù)制叉的誕生，關(guān)鍵是前導(dǎo)鏈合成的起始；前導(dǎo)鏈合成起始的關(guān)鍵又是引物的產(chǎn)生；引物產(chǎn)生的關(guān)鍵又是轉(zhuǎn)錄激活，也就是RNA聚合酶將復(fù)制原點(diǎn)的DNA序列轉(zhuǎn)錄成一系列長(zhǎng)度不等的RNA短鏈。至于轉(zhuǎn)錄激活所產(chǎn)生的RNA能否作為引物來引發(fā)前導(dǎo)鏈的合成，至今無定論。第三章-1DNA復(fù)制圖OriCinE.colichromosomalDNA

oriC與E.coli

復(fù)制的起始（P44）?四個(gè)9bp的重復(fù)序列

dnaA結(jié)合位點(diǎn)?三個(gè)13bp的重復(fù)序列若干GATC位點(diǎn)第三章-1DNA復(fù)制圖起始的過程打開DNA超螺鏈打開雙螺旋防止復(fù)螺旋單鏈結(jié)合蛋白解鏈酶引物復(fù)合體引物酶拓?fù)洚悩?gòu)酶合成第三章-1DNA復(fù)制圖復(fù)制起始1、拓?fù)洚悩?gòu)酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識(shí)別并在ATP存在下結(jié)合于四個(gè)9bp的重復(fù)序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個(gè)bp的重復(fù)序列,形成開鏈復(fù)合物。4、DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動(dòng)，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。起始復(fù)合物前引發(fā)復(fù)合物開鏈復(fù)合物第三章-1DNA復(fù)制圖復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈滯后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長(zhǎng)DNA鏈終止5′RNA引物3′3′半不連續(xù)復(fù)制過程

第三章-1DNA復(fù)制圖復(fù)制體第三章-1DNA復(fù)制圖專一性終止蛋白

E.coli

中由tusgene

編碼（terminusutilizationsubstance）通過抑制DNA解鏈酶而發(fā)揮終止作用每次復(fù)制時(shí)只使用一個(gè)終止位點(diǎn)ter第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖前導(dǎo)鏈合成是連續(xù)的，滯后鏈合成是不連續(xù)的；前導(dǎo)鏈上的DNA聚合酶Ⅲ全酶和滯后鏈上的引發(fā)體具有很高的進(jìn)行性，即不與DNA模板鏈解離，保證了前導(dǎo)鏈和滯后鏈復(fù)制的迅速進(jìn)行；前導(dǎo)鏈的合成總是領(lǐng)先一段，但沒跑太遠(yuǎn)，總是與滯后鏈保持相對(duì)穩(wěn)定的一段距離。第三章-1DNA復(fù)制圖

第四節(jié)真核生物的DNA聚合酶（P48）

α、β、δ、ε、γ五種

位置核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)線粒體

合成

與引發(fā)修復(fù)合成合成,修復(fù)復(fù)制功能酶結(jié)合

前導(dǎo)鏈后隨鏈3’－5’校NONOYesYesYes正活性

α

β

δ

ε

γ第三章-1DNA復(fù)制圖真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較第三章-1DNA復(fù)制圖真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的不同（P47）：第三章-1DNA復(fù)制圖第五節(jié)DNA損傷、修復(fù)和突變概述：損傷因素及其類型復(fù)制過程中的錯(cuò)配修復(fù)損傷修復(fù)第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖

廣義的修復(fù)系統(tǒng)：?DNA聚合酶的校對(duì)功能(復(fù)制的范疇)?錯(cuò)配修復(fù)?堿基切除修復(fù)（尿嘧啶-N-糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)）?核苷酸切除修復(fù)?直接修復(fù)(光復(fù)活、重組修復(fù)、SOS修復(fù)等)第三章-1DNA復(fù)制圖★錯(cuò)配修復(fù)(P50)DNA中的GATC為m6A甲基化敏感位點(diǎn)平均每2kb左右有一GATC

第三章-1DNA復(fù)制圖

甲基化程度的差異MutL/MutS掃描識(shí)別錯(cuò)配堿基和鄰近的GATC序列切點(diǎn)－－甲基化GATC中

G的5’側(cè)DNAhelicase,SSB,exonucleaseI去除包括錯(cuò)配堿基的片段DNApolymeraseIII和

DNAligase填充缺口昂貴的代價(jià)用于保證DNA的準(zhǔn)確性修復(fù)過程第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖堿基切除修復(fù)(P51)尿嘧啶-N-糖苷酶系統(tǒng)(ungsystem

)修復(fù)尿嘧啶的來源：dUTP的滲入胞嘧啶的自發(fā)脫氨氧化第三章-1DNA復(fù)制圖---TAGC------ATCG------TAGC------ACG---U---TAGC---尿嘧啶-N-糖苷酶

①GCUAU---TAGC------ACG---AP內(nèi)切酶(Apurinase)②---TAGC------ATCG---DNApol?Ligase

③第三章-1DNA復(fù)制圖★核苷酸切除修復(fù)(P54)

第三章-1DNA復(fù)制圖第三章-1DNA復(fù)制圖PR1、光復(fù)活（photoreactivation）----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----

復(fù)制前修復(fù)、不容易出錯(cuò)400nm藍(lán)光、PR酶

(photo-reactivationenzyme)

光敏裂合酶（photolyase）可見光激活二聚體修復(fù)的機(jī)制：第三章-1DNA復(fù)制圖2.切除修復(fù)Exision—Repair

復(fù)制前進(jìn)行不易出錯(cuò)UvrA,B,Cgen