2.2-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)課件廖

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景二.研究思路三、微生物的計(jì)數(shù)四、設(shè)置對(duì)照：五.實(shí)驗(yàn)流程六.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與鑒定一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+H2O+CO2NH33、常見(jiàn)的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線(xiàn)菌也能分解尿素。4、課題目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌1、實(shí)例：2、啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。發(fā)現(xiàn)：1996年在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)的。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。二.研究思路★為什么Taq細(xì)菌能從熱泉中被篩選出來(lái)？給了我們什么啟示？2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：方法：利用選擇培養(yǎng)基人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4實(shí)例、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？固體培養(yǎng)基②此培養(yǎng)基的碳源是③此培養(yǎng)基的氮源是④從功能上看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？葡萄糖尿素選擇培養(yǎng)基1.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）（1）常用方法：稀釋涂布平板法。（2）原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。（3）過(guò)程：①選平板（選擇菌落數(shù)在30——300個(gè)菌落的三個(gè)平板）②統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的菌落數(shù)目取平均值③計(jì)算每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。三、微生物的計(jì)數(shù)除此外還有濾膜法(4)現(xiàn)有一升水樣，用無(wú)菌吸管吸取1mL水樣至盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次稀釋103稀釋度。各取0.1mL已稀釋103倍的水樣分別接種到三個(gè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，記錄的菌落數(shù)分別為55、56、57，則每升原水樣中大腸桿菌數(shù)為_(kāi)_______。(55＋56＋57)÷3÷0.1×103×103＝5.6×108。注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來(lái)表示?！n本P22比較教材中兩位同學(xué)的操作方法，哪位同學(xué)的結(jié)果接近真實(shí)值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)呢？如需要，如何改進(jìn)？――第二位。兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)都需要改進(jìn)：第一位同學(xué)需設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)組，涂布至少3個(gè)平板；第二位同學(xué)統(tǒng)計(jì)的三個(gè)平板菌落數(shù)相差太大，說(shuō)明操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：抽樣檢測(cè)法利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀(guān)察；缺點(diǎn)：【對(duì)應(yīng)訓(xùn)練3】檢測(cè)員將1mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測(cè)的方法檢測(cè)每毫升藍(lán)藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計(jì)數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個(gè)計(jì)數(shù)室由25×16＝400個(gè)小格組成，容納液體的總體積為0.1mm3

現(xiàn)觀(guān)察到圖中該計(jì)數(shù)室所示a、b、c、d、e5個(gè)中格80個(gè)小格內(nèi)共有藍(lán)藻n個(gè)，則上述水樣中約有藍(lán)藻

個(gè)／mL。5n×105

原液所含細(xì)菌數(shù)/ml＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×l04×稀釋倍數(shù)平板劃線(xiàn)法稀釋涂布平板法接種環(huán)涂布器分離技術(shù)平板劃線(xiàn)法稀釋涂布平板法。接種技術(shù)計(jì)數(shù)技術(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）：稀釋涂布平板法無(wú)菌技術(shù)消毒滅菌設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。四、設(shè)置對(duì)照：實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))小結(jié)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。五.細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)流程土壤取樣→制備培養(yǎng)基樣品稀釋→取樣涂布→微生物的培養(yǎng)→觀(guān)察并記錄結(jié)果→細(xì)菌計(jì)數(shù)㈠.土壤取樣土壤中的微生物，大約70%-90%是細(xì)菌。細(xì)菌適宜在

的

潮濕土壤中生長(zhǎng)，絕大多數(shù)分布在距土表約3-8cm的土壤層。因此土壤取樣時(shí)，一般要鏟去

。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以

的選擇培養(yǎng)基。表層土酸堿度接近中性的尿素為唯一氮源樣品稀釋度將直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)，分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：

。目的：

。[三]樣品的稀釋不同微生物在土壤中含量不同保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板細(xì)菌稀釋度選

。放線(xiàn)菌稀釋度

。真菌的稀釋度

。104105

106

103104105

102103104

㈣.取樣涂布◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。㈤.微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔

統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取

的記錄作為結(jié)果?？梢苑乐挂蚺囵B(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落數(shù)目培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：

。放線(xiàn)菌：

。霉菌：

。30～37℃培養(yǎng)1～2d25～28℃培養(yǎng)5～7d25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d24h菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，這些特征包括

。菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面（1）原理：

。因此可通過(guò)檢測(cè)pH的變化來(lái)判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。（2）方法：以

的培養(yǎng)基中加入

指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌，若指示劑

，則pH升高，說(shuō)明該種細(xì)菌能分解尿素。脲酶六.課題延伸——菌種的進(jìn)一步鑒定CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3；由于NH3的產(chǎn)生，培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)，pH升高，尿素為唯一氮源酚紅變紅課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景二.研究思路三、微生物的計(jì)數(shù)四、設(shè)置對(duì)照：五.實(shí)驗(yàn)流程六.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與鑒定判斷正誤

(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(

)。

(2)篩選分解尿素的細(xì)菌應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源(

)。

(3)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌一般用平板劃線(xiàn)法(

)。

(4)在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍(lán)，則說(shuō)明篩選到分解尿素的細(xì)菌(

)。 答案(1)√

(2)√

(3)×

(4)×（新課標(biāo)I）2017年普通高校招生統(tǒng)一考試37．[生物——選修1：生物技術(shù)實(shí)踐]（15分）某些土壤細(xì)菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）有些細(xì)菌能分解尿素，有些細(xì)菌則不能，原因是前者能產(chǎn)生_________________。能分解尿素的細(xì)菌不能以尿素的分解產(chǎn)物CO2作為碳源，原因是_________________，但可用葡萄糖作為碳源，進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的葡萄糖的主要作用是________（答出兩點(diǎn)即可）。（2）為了篩選可分解尿素的細(xì)菌，在配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)選擇________________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作為氮源，不選擇其他兩組的原因是____________________。（3）用來(lái)篩選分解尿素細(xì)菌的培養(yǎng)基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________（答出兩點(diǎn)即可）?！敬鸢浮浚?）脲酶 分解尿素的細(xì)菌是異養(yǎng)型生物，不能利用CO2來(lái)合成有機(jī)物為細(xì)胞生物生命活動(dòng)提供能量，為其他有機(jī)物的合成提供原料（2）尿素 其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細(xì)菌和不能分解尿素的細(xì)菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用（3）為細(xì)菌生長(zhǎng)提供無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，作為緩沖劑保持細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中pH穩(wěn)定（新課標(biāo)I）2016年普通高校招生統(tǒng)一考試39.[生物——選修1]空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內(nèi)不同高度空氣中微生物的分布情況。實(shí)驗(yàn)步驟如下：①配置培養(yǎng)基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;②制作無(wú)菌平板；③設(shè)置空白對(duì)照組和若干實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行相關(guān)操作；④將各組平板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各組平板上菌落的平均數(shù)?；卮鹣铝袉?wèn)題:（1）該培養(yǎng)基中微生物所需的氮來(lái)源于_________________。若要完成步驟②，該培養(yǎng)基中的成分X通常是_________________。（2）步驟③中，實(shí)驗(yàn)組的操作是_________________。（3）若在某次調(diào)查中，某一實(shí)驗(yàn)組平板上菌落平均數(shù)為36個(gè)/平板，而空白對(duì)照組的一個(gè)平板上出現(xiàn)了6個(gè)菌落，這種結(jié)果說(shuō)明在此次調(diào)查中出現(xiàn)了_________________現(xiàn)象。若將30（即36-6）個(gè)/平板作為本組菌落數(shù)的平均值，該做法_______________（填“正確”或“不正確”）。【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨瓊脂（2）將各實(shí)驗(yàn)組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開(kāi)蓋暴露一段時(shí)間（3）污染不正確在完全正確的操作情況下，空白對(duì)照組中不應(yīng)出現(xiàn)菌落．若出現(xiàn)菌落，說(shuō)明操作過(guò)程中存在微生物污染，屬于實(shí)驗(yàn)失誤，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均不應(yīng)采用．（新課標(biāo)I）2015年普通高校招生統(tǒng)一考試39.[生物——選修1：生物技術(shù)實(shí)踐]（15分）已知微生物A可以產(chǎn)生油脂，微生物B可以產(chǎn)生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生產(chǎn)。回答有關(guān)問(wèn)題：（1）顯微觀(guān)察時(shí)，微生物A菌體中的油脂通常可用于

染色。微生物A產(chǎn)生的油脂不易揮發(fā)，可選用

（填“萃取法”或“水蒸氣蒸餾法”）從菌體中提取。（2）為了從自然界中獲得能產(chǎn)生脂肪酶的微生物B的單菌落，可從含有油料作物種子腐爛物的土壤中取樣，并應(yīng)選用以

為碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（3）若要測(cè)定培養(yǎng)液中微生物B的菌體數(shù)，可在顯微鏡下用

直接計(jì)數(shù)；若要測(cè)定其活菌數(shù)量，可選用

法進(jìn)行計(jì)數(shù)。（4）為了確定微生物B產(chǎn)生的脂肪酶的最適溫度，某同學(xué)測(cè)得相同時(shí)間內(nèi)，在35℃、40℃、45℃溫度下降解10g油脂所需酶量依次為4mg、1mg、6mg，則上述三個(gè)溫度中，

℃條件下該酶活力最小。為了進(jìn)一步確定該酶的最適溫度，應(yīng)圍繞℃設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！敬鸢浮浚?）蘇丹III（或者蘇丹IV）萃取法油脂血細(xì)胞計(jì)數(shù)板稀釋涂布平板4540（新課標(biāo)II）2014年普通高校招生統(tǒng)一考試選修1：為了調(diào)查某河流的水質(zhì)狀況，某講究小組測(cè)定了該河水流樣中的細(xì)菌含量，并進(jìn)行了細(xì)菌分離等工作。回答下列問(wèn)題：（1）該小組采用稀釋涂布平板檢測(cè)水樣中的細(xì)菌含量。在涂布接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時(shí)間，這樣做的目的是__________;然后，將1mL水樣稀釋100倍，在3個(gè)平板上涂布法分別接入0.1mL稀釋液：經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為39、38、和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為_(kāi)_________。（2）該小組采用平板劃線(xiàn)法分離水樣中的細(xì)菌。操作時(shí)，接種環(huán)通過(guò)_______滅菌，在第二次及以后的劃線(xiàn)時(shí)，總是從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)始劃線(xiàn)。這樣做的目的是__________。（3）示意圖A和B中，__________表示的是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。(4)該小組將得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中并混勻，一部分進(jìn)行靜置培養(yǎng)，另一部分進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌比靜置培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)速度快。分析其原因是：震蕩培養(yǎng)能提高養(yǎng)液中__________的含量，同時(shí)可使用菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高_(dá)_________的利用率。（1）檢測(cè)培養(yǎng)基平板滅菌是否合格3.8×107（2）灼燒；將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個(gè)菌落（3）B（4）溶解氧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（新課標(biāo)II）2013年普通高校招生統(tǒng)一考試臨床試用抗生素前，有時(shí)需要做細(xì)菌耐藥實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要從病人身上獲取少量樣本，然后按照一定的實(shí)驗(yàn)步驟操作，以確定某致病菌對(duì)不同抗生素的敏感性。 回答下列問(wèn)題：（1）為了從樣本中獲取致病菌菌落，可用_______法或_________法將樣本接種種于固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)、鑒別等步驟獲得。（2）取該單菌落適當(dāng)稀釋?zhuān)胈_____法接種于固體培養(yǎng)基表面，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使其均勻生長(zhǎng)，布滿(mǎn)平板。（3）為了檢測(cè)該致病菌對(duì)于抗生素的敏感性，將分別含有A，B，C，D四種抗生素的濾紙片均勻置于該平板上的不同位置，培養(yǎng)一段時(shí)間后，含A的濾紙片周?chē)霈F(xiàn)透明圈，說(shuō)明該致病菌對(duì)抗生素A_______；含B的濾紙片周?chē)鷽](méi)有出現(xiàn)透明圈，說(shuō)明該致病菌對(duì)抗生素B_____；含C的濾紙片周?chē)耐该魅Ρ群珹的小，說(shuō)明________；含D的濾紙片周?chē)耐该魅σ脖群珹的小，且透明圈中出現(xiàn)了一個(gè)菌落，在排除雜菌