自殺基因治療法-腫瘤克星分析

自殺基因治療法--腫瘤克星

盡管腫瘤治療技術(shù)在不斷提高和改進(jìn),但每年因患腫瘤而逝世的病人仍在不斷增多。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法,如外科切除、放射治療和化學(xué)藥物治療并不能完全地治愈腫瘤,這就需要引入一種新的安全有效的腫瘤治療技術(shù)。對腫瘤分子水平上的研究已經(jīng)證實，所有腫瘤都伴隨有基因突變的存在，都是繼基因型變化后發(fā)生表型的變化。由此，人們推斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與基因的變化有關(guān)聯(lián)．因而在生物療法中基因治療是最具潛力的。

至20世紀(jì)80年代后期,隨著生物學(xué)的發(fā)展,基因療法開始應(yīng)用于腫瘤治療。一.概述

基因療法：利用健康基因填補(bǔ)或替代基因疾病中某些缺失或病變的基因。目前做法是先從患者體內(nèi)獲取部分細(xì)胞，以對人體無害的逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把正常的基因克隆到病毒上，然后再用這些病毒去感染人體細(xì)胞，通過它們把正常基因插進(jìn)細(xì)胞的染色體中，使人體細(xì)胞“獲得”正常的基因，以取代原有的異?；颉?/p>

現(xiàn)在常用的基因治療技術(shù)主要通過以下幾種策略來完成對腫瘤的治療：

(1)基因替換和基因補(bǔ)充，轉(zhuǎn)換突變的癌基因或補(bǔ)充腫瘤細(xì)胞中缺失的抑癌基因；(2)基因?qū)胍栽鰪?qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗癌效能；如：導(dǎo)入細(xì)胞因子基因或免疫共刺激分子基因以增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的殺癌能力；(3)基因?qū)胍栽鰪?qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，如：導(dǎo)入MHCI類抗原基因；(4)腫瘤藥物敏感基因治療--自殺基因的應(yīng)用；(5)腫瘤藥物耐受基因--治療造血功能的保護(hù)；(6)反意治療技術(shù)：根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，人工合成特定DNA或RNA片段（或其他化學(xué)修飾產(chǎn)物）抑制或封閉癌基因表達(dá)；(7)誘導(dǎo)分化治療：在分化誘導(dǎo)劑的作有用下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化以達(dá)到治療癌癥的目的。藥物敏感基因---自殺基因治療日益受國內(nèi)外腫瘤研究者的關(guān)注.自殺基因治療（suicidegene），是指將某些病毒或細(xì)菌的基因?qū)氚屑?xì)胞中，其表達(dá)的酶可催化無毒的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒物質(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞被殺死。這類基因稱為自殺基因，又稱藥物敏感性基因。目前在基因治療中常用的自殺基因系統(tǒng)有大腸桿菌胞嘧碇脫氨酶基因（EC-CD），TK-GCV系統(tǒng)、CD-5-FC系統(tǒng)等。自殺基因療法應(yīng)用較為廣泛，它除了應(yīng)用于腫瘤，骨髓移植，心血管疾病等的治療。自殺基因治療法治療腫瘤的基本步驟：（1）尋找具有治療意義的目的基因；（2）建立行之有效的向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng)；（3）目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到治療目的；二.自殺基因治療法（一）選擇有效的外源基因（1）HSV-TK/GCV系統(tǒng)：

HSV-TK（單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶）基因：該類基因相對于哺乳動物的TK基因，更易使抗皰疹的核苷類似物磷酸化成為環(huán)腺苷-磷酸；作用原理：抗皰疹的核苷類似物

環(huán)腺苷一磷酸環(huán)腺苷三磷酸，通過DNA聚合酶α加入到DNA復(fù)制中，導(dǎo)致鏈反應(yīng)終止以及DNA鏈斷裂。轉(zhuǎn)導(dǎo)了HSV-TK的腫瘤細(xì)胞可被清除。研究表明，只要轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的10%~70%就可使腫瘤完全被清除。（旁觀者效應(yīng)，磷酸化的核苷可通過細(xì)胞間隙從陽性細(xì)胞傳遞到周圍細(xì)胞以及轉(zhuǎn)導(dǎo)后的腫瘤細(xì)胞可以分泌白細(xì)胞介素IL-6和IL-1作為旁分泌因子介導(dǎo)細(xì)胞的死亡）HSV-TK（磷酸化）激酶（2）CD/5-FC系統(tǒng)：CD（胞嘧啶脫氨酶），在細(xì)菌和真菌中表達(dá)而在哺乳動物中不表達(dá)；

無毒性的前體藥物5-氟胞嘧啶（5-FC）5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-FU可轉(zhuǎn)化為脫氫核苷酸環(huán)腺苷一磷酸(FUTP)，或者直接摻入RNA干擾rRNA和mRNA的功能。此系統(tǒng)也有旁觀者基因的存在。5-FU很容易在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外通過非易化擴(kuò)散?？拷D(zhuǎn)導(dǎo)CD后的細(xì)胞的其他細(xì)胞也被抑制，即使只有2%細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)，腫瘤也能明顯被抑制。CD（二）基因?qū)氲妮d體有效的基因治療依賴于外源基因高效而穩(wěn)定的表達(dá)。目前使用的載體有兩大類：轉(zhuǎn)染性載體（利用化學(xué)或物理方法增加膜的通透性而將DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，有脂質(zhì)體和基因槍）和轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體（利用病毒對細(xì)胞的天然親和力把遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞）。

病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性而成為腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒（AV）、腺相關(guān)病（AAV）、單純皰疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等載體。

導(dǎo)入目的基因的方法：

體外法：從患者體內(nèi)取出細(xì)胞，在體外培養(yǎng)并轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪x擇系統(tǒng)，把重組的受體細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，讓外源基因表達(dá)

體內(nèi)法：不需細(xì)胞移植而直接將外源DNA注射至體內(nèi)，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)而發(fā)揮治療作用。常用的轉(zhuǎn)移手段有病毒介導(dǎo)、寡核苷酸直接注射、受體介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)和體內(nèi)基因直接注射等?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性帶有目的基因的載體如何到達(dá)“靶細(xì)胞”是治療的關(guān)鍵，只有提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性才能實現(xiàn)治療的針對性和安全性，目前解決基因的靶向轉(zhuǎn)移及表達(dá)有三種策略：（1）利用基因工程手段改造基因載體，使所包裝的重組病毒特異性地識別位于靶細(xì)胞表面的抗原或受體決定簇；（2）在體內(nèi)基因傳遞系統(tǒng)中共價連接腫瘤抗體和腫瘤細(xì)胞特異受體的配基，使基因在類似“生物導(dǎo)彈”作用下被送到腫瘤細(xì)胞表面；（3）應(yīng)用腫瘤細(xì)胞特異蛋白管家基因的表面調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)。

各種組織靶向細(xì)胞及其優(yōu)點：骨髓：容易獲得；可體外培養(yǎng)；易返回機(jī)體上皮細(xì)胞：使用腺病毒可在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入呼呼上皮；經(jīng)內(nèi)窺鏡接近腸上皮進(jìn)行體細(xì)胞基因療法皮膚：最容易大面積接近的組織；干細(xì)胞可使表面持續(xù)更新；皮膚中轉(zhuǎn)基因表達(dá)可影響全身血管內(nèi)皮；外源性遺傳物質(zhì)可轉(zhuǎn)入血管組織內(nèi)皮細(xì)胞間皮：間皮覆蓋了體腔內(nèi)表面，由單層細(xì)胞組成肌肉：裸露質(zhì)粒DNA可注射轉(zhuǎn)入骨骼肌或心肌?；蜣D(zhuǎn)入骨骼肌后可在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)并釋放治療性蛋白質(zhì)神經(jīng)：基因?qū)肽X循環(huán)；基因?qū)肽X脊液；CNS間接打靶技術(shù)肝臟：肝臟疾病的基因療法的重要靶器官胰腺：基因轉(zhuǎn)入胰腺為治療胰腺癌等提供了可能眼組織：眼組織內(nèi)注射可作為基因治療的靶

雖然基因治療法這項技術(shù)在許多醫(yī)療方面已經(jīng)獲得不少進(jìn)步，但要想成功地將其運(yùn)用到醫(yī)療實踐當(dāng)中以攻克腫瘤卻是任重而道遠(yuǎn)。

存在哪些問題？（一）“旁觀者效應(yīng)”的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究“旁觀者效應(yīng)”(by—standereffect)：即導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細(xì)胞對鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。具體作用機(jī)制目前有五種觀點：縫隙連接、細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫、介質(zhì)擴(kuò)散、腫瘤缺血壞死。

縫隙連接：為大多數(shù)研究者所認(rèn)同。該假說認(rèn)為轉(zhuǎn)染自殺基因的細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷性物質(zhì)是通過細(xì)胞間的縫隙連接傳遞到臨近細(xì)胞的．這種現(xiàn)象又稱之為“死亡之吻”(kissofdeath)。細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染自殺基因的腫瘤細(xì)胞死亡之后產(chǎn)生凋亡小體，其凋亡小泡包裹著自殺基因的表達(dá)產(chǎn)物和一些毒性代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物被鄰近的未轉(zhuǎn)染自殺基因的腫瘤細(xì)胞吞噬，從而引起腫瘤細(xì)胞的繼發(fā)凋亡。免疫作用：轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的HSV—TK可以改變腫瘤組織內(nèi)的微環(huán)境，使之從免疫抑制狀態(tài)到免疫激活狀態(tài)。Hogge,-laj和Shi0兩學(xué)者報道自殺基因引起腫瘤細(xì)胞死亡后．釋放出腫瘤源性肽類被APC攝取，然后激活CTI細(xì)胞．而局部GM—CSF的表達(dá)能增強(qiáng)這種抗原遞呈功能，從而達(dá)到增強(qiáng)旁觀者效應(yīng)。介質(zhì)擴(kuò)散：互相不接觸的腫瘤細(xì)胞也能發(fā)生旁觀者效應(yīng)。在細(xì)胞質(zhì)中的分子和離子．只要其分子量小于1kDa時．它們就可以自由出入細(xì)胞。某些自殺基因系統(tǒng)的前體藥物在酶的作用下產(chǎn)生有毒性的小分子代謝產(chǎn)物，如CD／5一FC系統(tǒng)的毒性產(chǎn)物5-FU，5-FU能夠自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞將腫瘤細(xì)胞殺死腫瘤缺血壞死：以Ram為首等人發(fā)現(xiàn)．由于腫瘤分泌血管生長因子，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血管的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活躍．易于被攜帶TK基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所染．經(jīng)GCV治療后，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞被有效地殺傷．從而抑制了腫瘤血管生長，減少腫瘤的血供，使腫瘤缺血壞死。

在腫瘤治療中，盡管自殺基因療法具有很大潛力，但目前進(jìn)行的工作還是探索性的，絕大多數(shù)尚處于實驗階段，要使自殺基因治療成為臨床上安全有效的抗腫瘤治療方法，尚存在許多問題需要解決。三.存在哪些問題？（一）還需進(jìn)一步研究“旁觀者效應(yīng)”的機(jī)制

“旁觀者效應(yīng)”(by—standereffect)：即導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細(xì)胞對鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。具體作用機(jī)制目前有五種觀點：縫隙連接、細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫、介質(zhì)擴(kuò)散、腫瘤缺血壞死

基因治療的載體系統(tǒng)要求：（1）轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。（2）表達(dá)穩(wěn)定。（3）安全。目前用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，脂質(zhì)體等，但各載體各有其優(yōu)缺點如：應(yīng)用較廣的鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒MoMLV，感染效率高，能持續(xù)表達(dá)，較安全但其攜帶外源基因的容量較小，且感染特異性不高，重組病毒的概率較低。腺病毒載體的優(yōu)點是感染效率高，可攜帶的基因較大，致死性和致瘤性低，使用安全，缺點是不能持續(xù)表達(dá)，不能反復(fù)使用。因此，還必須加強(qiáng)基因治療的靶向性研究，開發(fā)出新的既安全又高效的載體系統(tǒng)。（二）載體難尋（三）作用不持久進(jìn)一步研究自殺基因系統(tǒng)和機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用機(jī)制，以激活和增強(qiáng)機(jī)體強(qiáng)大而持久的抗腫瘤免疫。新的希望：聯(lián)合基因治療聯(lián)用TK、mIL-2及粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因治療肝轉(zhuǎn)移灶，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗腫瘤免疫更持久。

鑒于癌癥仍為威脅人類健康的一類頑固性疾病，目前的化療、放療及手術(shù)治療等方法的作用都有局限，作為新興的生物療法中的自殺基因治療在許多方面都因其獨(dú)特的作用機(jī)制而顯示出巨大的潛能．由于目前自殺基因療法還沒有大規(guī)模地進(jìn)入臨床實驗．所以我們還無法準(zhǔn)確預(yù)測其在未來癌癥治療中的作用，但或許它就是癌癥的終結(jié)者。根據(jù)目前自殺基因治療的現(xiàn)狀，我們相信這一療法會在未來有所發(fā)展，有所突破，為人類造福。四.展望

首先，還是如何增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、精確靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)、時空調(diào)