GB-T 38133-2019 轉(zhuǎn)基因苜蓿實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

ICS07.080A40中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因苜蓿實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法G-PCR2019-10-18發(fā)布2019-10-18實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局ⅠGB／T38133—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC387)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、廣州海關(guān)技術(shù)中心、廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。1GB／T38133—2019轉(zhuǎn)基因苜蓿實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了苜蓿轉(zhuǎn)基因成分的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)定性檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于種子、飼料中的轉(zhuǎn)基因苜蓿以及KK179品系的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1基因編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因。注：在本標(biāo)準(zhǔn)中作為苜蓿的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。3.218S核糖體RNA18SrRNA編碼真核生物18S核糖體RNA的基因。注1：在本標(biāo)準(zhǔn)中作為苜蓿的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。注2：實(shí)際檢測(cè)中，3.1和3.2選擇一種使用即可。3.3啟動(dòng)子編碼玄參花葉病毒的35S啟動(dòng)子的基因。注：在本標(biāo)準(zhǔn)中作為轉(zhuǎn)基因苜蓿和的啟動(dòng)子。3.4終止子來(lái)源于源自豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基（基因的3′非翻譯區(qū)，存在于轉(zhuǎn)基因苜蓿與品系中。3.5基因源自菌株，用于編碼莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶的基因，存在于轉(zhuǎn)基因苜蓿品系中。2GB／T38133—20193.6基因的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽用于引導(dǎo)蛋白在芳香族氨基酸合成的基因。3.7NO終止子來(lái)自根癌農(nóng)桿菌序列區(qū)，用于編碼NOS，指導(dǎo)聚腺苷酸化的基因，存在于轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179品系中。3.8啟動(dòng)子來(lái)自菜豆的基因啟動(dòng)子，含有指導(dǎo)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的編碼苯丙氨酸解氨酶的基因，存在于轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179品系中。4試驗(yàn)原理應(yīng)用探針技術(shù)，根據(jù)常用的篩選基因（啟動(dòng)子、終止子等）序列、品系特異性序列和苜蓿內(nèi)源基因序列，設(shè)計(jì)引物和熒光探針，對(duì)樣品中基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此可根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度判定樣品中是否含有特定的基因。5試劑與材料除另有說(shuō)明，本方法僅使用分析純?cè)噭┖椭卣麴s水或符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1DNA提取試劑盒。5.2實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液。5.3內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物和探針（探針5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)）。5.3.1ACC基因引物和探針：上游引物下游引物探針基因引物和探針：上游引物下游引物探針5.4外源基因引物和探針（探針5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)）。轉(zhuǎn)化事件特異性序列引物和探針：上游引物下游引物探針轉(zhuǎn)化事件特異性序列引物和探針：上游引物下游引物探針5.4.3KK179轉(zhuǎn)化事件特異性序列引物和探針：3GB／T38133—2019上游引物下游引物探針5.4.4FMV35S啟動(dòng)子基因引物和探針：上游引物下游引物探針5.4.5CTP2基因引物和探針：上游引物下游引物探針5.4.6CP4-EPSPS基因引物和探針：上游引物下游引物探針5.4.7E9基因引物和探針：上游引物下游引物探針基因引物和探針：上游引物下游引物探針5.4.9NOS終止子基因引物和探針：上游引物下游引物探針6儀器與設(shè)備6.2生物安全柜。6.3實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀。6.4重蒸餾水發(fā)生器或純水儀。6.5渦旋振蕩儀。6.6其他相關(guān)儀器和設(shè)備。6.7不同量程移液器。7操作步驟按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。4GB／T38133—2019按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。7.3試樣預(yù)處理按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。7.4DNA模板制備按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。提取后的DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處吸收值，分別計(jì)算核酸濃度不低于7.5實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)7.5.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)對(duì)照組設(shè)置每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)每次檢測(cè)設(shè)立3個(gè)對(duì)照：a)陽(yáng)性對(duì)照：為對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物樣品品系或含有相應(yīng)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物樣品基因組DNA,或含有上述片段的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)／樣品；b)陰性對(duì)照：為非轉(zhuǎn)基因苜蓿提取的基因組；c)空白對(duì)照：PCR反應(yīng)的空白對(duì)照（以重蒸餾水代替DNA模板）。7.5.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系配制見(jiàn)表1,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。表1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分儲(chǔ)存濃度加樣體系/μL終濃度實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液 上游引物1下游引物1探針05DNA模板 250ng~250ng超純水 注1：實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液中包含有PCR擴(kuò)增酶、擴(kuò)增緩沖液以及dNTP等組分，可選擇單獨(dú)的PCR擴(kuò)增酶以及相應(yīng)的擴(kuò)增緩沖液、dNTP等反應(yīng)組分進(jìn)行試驗(yàn)，以上組分的添加量按照產(chǎn)品說(shuō)明書使用。注2：反應(yīng)體系中的各組分可根據(jù)不同最終反應(yīng)體系進(jìn)行區(qū)分，但是需保持所有組分終濃度一致。7.5.3實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增程序?qū)崟r(shí)熒光反應(yīng)參數(shù)為個(gè)循環(huán)。注：95℃/10min的專門適用于化學(xué)變構(gòu)的熱啟動(dòng)Taq酶。以上參數(shù)可根據(jù)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR儀和所選PCR擴(kuò)增試劑體系的不同進(jìn)行調(diào)整。若未加入尿嘧啶-N-糖基化酶則不需要50℃/2min步驟。5GB／T38133—20197.5.4實(shí)時(shí)熒光PCR儀熒光基團(tuán)的設(shè)置設(shè)置PCR反應(yīng)管熒光信號(hào)收集條件，應(yīng)與探針標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法可參照儀器使用說(shuō)明書。8結(jié)果分析與表述8.1對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果分析空白對(duì)照：內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值大于或等于40,外源基因或品系特異性檢測(cè)Ct值大于或等于40。陰性對(duì)照：內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值小于或等于30,轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)Ct值大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照：內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值小于或等于30,轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)Ct值小于或等于30。上述指標(biāo)有一項(xiàng)不符合者，說(shuō)明PCR反應(yīng)體系不正常，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。8.2試樣檢測(cè)結(jié)果分析和表述8.2.1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增曲線形狀良好，擴(kuò)增Ct值小于或等于30;外源基因擴(kuò)增曲線形狀良好，擴(kuò)增Ct值大于或等于40,這表明試樣中該樣品不含所檢基因或品系，表述為“未檢測(cè)出×××基因成分”。8.2.2內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增曲線形狀良好，擴(kuò)增Ct值小于或等于30;外源基因擴(kuò)增曲線形狀良好，擴(kuò)增Ct值小于或等于36,這表明試樣中檢測(cè)出了所檢基因或品系基因成分，表述為“檢出×××基因成分”。值在36~40之間，應(yīng)調(diào)整模板濃度，重做實(shí)時(shí)熒光PCR。再次擴(kuò)增后的外源基因檢測(cè)值仍小于40,則可判定為該樣品含有所檢基因或品系。再次擴(kuò)增后的外源基因檢測(cè)Ct值大于或等于40,則可判定為該樣品不含所檢基因或品系。8.3篩選檢測(cè)和鑒定檢測(cè)的選擇對(duì)苜蓿樣品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，可參考附錄A,先篩選檢測(cè)FMV35S啟動(dòng)子基因、E9基因、CP4-EPSPS基因、CTP2基因、NOS終止子、Pal2啟動(dòng)子，篩選檢測(cè)結(jié)果陰性則直接報(bào)告結(jié)果。若篩選檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，則需進(jìn)一步鑒定檢測(cè)以及KK179品系特異性基因，以確定是何種轉(zhuǎn)基因苜蓿品系。9防污染措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。10樣品和原始數(shù)據(jù)保存存查樣品應(yīng)視樣品的狀態(tài)采用相應(yīng)的保存方式，妥善保存6個(gè)月。如發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，該樣品保存1年，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁。保存期滿后，需經(jīng)處理。10.2原始數(shù)據(jù)保存轉(zhuǎn)基因樣品檢測(cè)結(jié)束后，其原始記錄單和檢驗(yàn)報(bào)告或證書應(yīng)歸檔，妥善保管，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁。6GB／T38133—2019附錄A（資料性附錄）本標(biāo)準(zhǔn)中的外源篩選基因在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因苜蓿中的信息A.1本標(biāo)準(zhǔn)中的外源篩選基因在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因苜蓿中的覆蓋情況見(jiàn)表A.1。表A.1本標(biāo)準(zhǔn)中的外源篩選基因在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因苜蓿中的覆蓋情況品系名稱外源基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)基因終止子FMV35S啟動(dòng)子基因CP4-EPSPS基因、CTP2基因E9基因FMV35S啟動(dòng)子基因CP4-EPSPS基因、CTP2基因E9基因KK179P NOS終止子A.2本標(biāo)準(zhǔn)中的外源篩選基因在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因苜蓿中的序列信息轉(zhuǎn)基因苜蓿注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)橐约皡^(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)閰^(qū)域。轉(zhuǎn)基因苜蓿ATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGTCCA注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)橐约皡^(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)閰^(qū)域。轉(zhuǎn)基因苜蓿TCTTTTAATCTTCGATATCTTACTTTAGCCTAG注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)镵K179-F以及KK179-R區(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)镵K179-P區(qū)域。啟動(dòng)子目標(biāo)序列TTGAGCTCAGGATTTAGCAGCATTCCAGATTG注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)镕MV35S-F以及FMV35S-R區(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)镕MV35S-P區(qū)域。A.2.5CTP2基因目標(biāo)序列GB／T38133—2019CGAGCTTATCCGATTTCGTCGTCGTGGGGATTGAAGAAGAGTGGGATG注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)镃TP2-F以及CTP2-R區(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)镃TP2-P區(qū)域。A.2.6CP4-EPSPS基因目標(biāo)序列注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)镋PSPS-F以及EPSPS-R區(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)镋PSPS-P區(qū)域。A.2.7E9基因目標(biāo)序列注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)镋9-F以及E9-R區(qū)域，雙下劃線區(qū)域?yàn)镋9-P區(qū)域。A.2.8Pal2基因目標(biāo)序列CCCTAACACTCTCCGTTATATATAACCCCTTCATGAACAAGGCTAATCATTCACCACATTACGCACTAC注：?jiǎn)蜗聞澗€區(qū)域?yàn)镻al2-F以及Pal2-R