生物（人教版選修3）課件12基因工程的基本操作程序

1．2基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}一基因工程1．了解目的基因獲取的常用方法。2．理解基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心。3．掌握將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。4．理解目的基因的檢測與鑒定。一、基因工程的基本操作程序編碼蛋白質(zhì)

所有

一部分

(2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因：①含義：是一項在生物體外

的核酸合成技術(shù)。②原理：

。③條件：

、DNA模板、Taq酶、四種脫氧核苷酸。復(fù)制特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制引物④過程：目的基因DNA受熱

后解鏈為單鏈

與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合

在

作用下進行

重復(fù)循環(huán)多次⑤結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成

形式擴增(2n)。變性引物DNA聚合酶延伸指數(shù)(3)人工合成法：①條件：基因較小，

又已知；②方法：通過

用化學(xué)方法直接人工合成。核苷酸序列DNA合成儀1．探討基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫有何關(guān)系？提示：基因組文庫含有一種生物的全部基因，而cDNA文庫只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫。三、基因表達載體的構(gòu)建1．構(gòu)建目的(1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以

給下一代。(2)使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。遺傳表達2．構(gòu)建零件2．終止子和終止密碼子是否一樣？提示：終止子是指DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的三個相鄰堿基；終止密碼子是指mRNA分子上決定翻譯停止的三個相鄰堿基。目的基因

維持穩(wěn)定

表達

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

花粉管通道法

(2)農(nóng)桿菌特點①易感染

和

。②Ti質(zhì)粒上的

可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞

上。3．導(dǎo)入動物細(xì)胞(1)方法：

技術(shù)。(2)常用受體細(xì)胞：

。雙子葉植物裸子植物T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)染色體的DNA顯微注射受精卵4．導(dǎo)入微生物細(xì)胞(1)原核生物特點：

、多為

、遺傳物質(zhì)相對

等。(2)對受體細(xì)胞的常用處理方法：用

處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)胞稱為

)。繁殖快單細(xì)胞較少Ca2＋感受態(tài)細(xì)胞2．個體生物學(xué)水平上的檢測與鑒定：如一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的

。蛋白質(zhì)

接種實驗3．要檢測目的基因是否成功地插入了受體DNA中，需要用基因探針，基因探針是指什么？提示：用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子。一、PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的區(qū)別1．PCR技術(shù)擴增目的基因的原理及過程(1)原理：利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量成指數(shù)方式增加。(2)過程：如圖所示。從上圖中可以看出利用設(shè)計的特異性引物對cDNA文庫進行PCR擴增，提取出了相應(yīng)的目的基因，而不是對cDNA文庫進行簡單、全面地復(fù)制。2．PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較【特別提醒】PCR技術(shù)利用熱變性解旋與復(fù)性，所以用耐高溫的DNA聚合酶，同時需設(shè)計引物，由于DNA解旋是在高溫下變性實現(xiàn)的，故不再需解旋酶。

資料顯示，近10年來，PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實驗室的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA的半保留復(fù)制，在試管中進行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在很短的時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。請據(jù)圖回答：(1)加熱至94℃的目的是使DNA中的______鍵斷裂，這一過程在細(xì)胞內(nèi)是通過______的作用來完成的。(2)當(dāng)溫度降低時，引物與模板末端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成2個DNA分子，此過程中原料是______，遵循的原則是________________________。(3)請指出PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄過程的三個不同之處：①_____________________________________________；②______________________________________________；③_____________________________________________。(4)Taq酶的特點是________。A．耐強酸 B．耐強堿C．耐高溫 D．最適溫度37℃解析：(1)94℃時DNA雙鏈解旋，破壞的是兩條鏈之間的氫鍵，而在細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制解旋時解旋酶起相同作用。(2)PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程原理是相同的，即堿基互補配對，原料均為4種脫氧核苷酸。(3)PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄區(qū)別很大。如下表：(4)Taq酶適于在高溫條件下發(fā)揮作用。答案：(1)氫解旋酶(2)4種脫氧核苷酸堿基互補配對原則(3)①PCR技術(shù)以DNA的兩條單鏈為模板合成子代DNA，轉(zhuǎn)錄以DNA的一條單鏈為模板合成RNA

②PCR技術(shù)的原料為脫氧核苷酸，轉(zhuǎn)錄的原料是核糖核苷酸③二者反應(yīng)時的催化酶不同(或其他合理答案)

(4)C解析：PCR技術(shù)是在生物體外進行DNA復(fù)制的技術(shù)，其原理與DNA復(fù)制的原理是相同的，但前提是必須要有一段已知的目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。答案：A二、目的基因的導(dǎo)入與檢測1．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程(2)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的常用方法2.目的基因的檢測與鑒定(1)操作目的檢測和鑒定目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性是基因工程最為關(guān)鍵的一步。(2)目的基因檢測與鑒定的方法比較【特別提醒】(1)原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少。(2)目的基因進入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。(3)構(gòu)建基因表達載體(核心步驟)。

農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下圖為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖，試回答下列問題：(1)一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是______，利用農(nóng)桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現(xiàn)______。具體原理是在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上存在T-DNA片段，它具有可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞______上的特點，因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入到______(部位)即可。(2)根據(jù)T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點，推測該DNA片段上可能含有控制______(酶)合成的基因。(3)圖中c過程中，能促進農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移的物質(zhì)是______類化合物。(4)要獲取能表現(xiàn)出新性狀的植株，d過程涉及的生物學(xué)技術(shù)是______。(5)植物基因工程中除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還可采取______方法。(至少寫出兩種)解析：(1)一般農(nóng)桿菌不能感染的植物是單子葉植物，可感染雙子葉植物和裸子植物。利用其感染性，可實現(xiàn)目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞。真正可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上的是農(nóng)桿菌T-DNA片段，因此目的基因必須插入到該部位才能成功。(2)根據(jù)T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點，可以推測該DNA片段能控制合成DNA連接酶、限制酶以實現(xiàn)與雙子葉植物細(xì)胞染色體DNA的整合。(3)植物細(xì)胞受傷后可產(chǎn)生酚類物質(zhì)，促進農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

(4)d過程涉及的生物學(xué)技術(shù)是植物組織培養(yǎng)，通過脫分化、再分化，最終形成植物體。(5)植物基因工程中除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還有基因槍法和花粉管通道法等。答案：(1)單子葉植物目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞染色體的DNA

T-DNA片段(內(nèi)部)

(2)DNA連接酶、限制酶(3)酚(4)植物組織培養(yǎng)技術(shù)(5)基因槍法、花粉管通道法【互動探究】

(1)怎樣操作能使農(nóng)桿菌感染單子葉植物？(2)根據(jù)題干分析，為什么動植物病毒也可作為基因工程的載體？提示：(1)可在單子葉植物受損處涂加酚類物質(zhì)來吸引農(nóng)桿菌。(2)病毒能夠侵染正常細(xì)胞，有的病毒還能將自己的核酸整合到宿主細(xì)胞的染色體上，所以可以作為基因工程的載體?！痉椒记伞拷獯鸹蚬こ袒静僮鞒绦蝾}目的一般步驟——三辨、三找、一析、一理(1)三辨：分辨限制酶的種類及識別序列和切割位點。在切割目的基因和載體時，一般用同一種限制酶切割，也可用不同的限制酶切割，但兩種限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端中堿基要互補配對。(2)三找：找出標(biāo)記基因、目的基因及其插入位點。一般來說，質(zhì)粒中至少有一個標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。明確目的基因的插入位點是在標(biāo)記基因內(nèi)部還是在標(biāo)記基因之外。(3)一析：分析目的基因插入質(zhì)粒后是否破壞了標(biāo)記基因。如果質(zhì)粒中有一個標(biāo)記基因，插入后一般不破壞標(biāo)記基因；如果質(zhì)粒中有兩個標(biāo)記基因，則需看標(biāo)記基因中是否有插入位點，如果某一標(biāo)記基因中有插入位點，則目的基因插入質(zhì)粒后該標(biāo)記基因被破壞。(4)一理：理清判斷目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法。一般用含有某種抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體菌，如果有兩種抗生素基因，還需判斷用哪一種抗生素來檢測。2．科研人員以抗四環(huán)素基因為標(biāo)記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細(xì)胞貧血癥。下列相關(guān)實驗設(shè)計中，不合理的是(

)A．利用小鼠DNA分子通過PCR克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列B．用編碼序列加啟動子、抗四環(huán)素基因等元件來構(gòu)建表達載體C．用Ca2＋處理大腸桿菌后，將表達載體導(dǎo)入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中D．用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β-珠蛋白基因編碼序列的大腸桿菌解析：具有特定抗性基因的運載體，導(dǎo)入不含該抗性基因的受體生物中，才能進行篩選。答案：C尋根問底1．為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？(教材P9)提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，但并不是唯一的方法。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不