微生物染色鏡檢法

1、微生物染色鏡檢法

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微生物細胞含水量一般為80?90%,菌細胞對光的吸收和反

射與水相近，在光學(xué)顯微鏡下菌體透明，與背景幾無反差，故常

借助于染色使菌體吸著染料產(chǎn)生與背景較明顯的差別，從而識別

其個體形態(tài)和部分結(jié)構(gòu)。

1、1常用染色法

細菌染色分為單染色法和復(fù)染色法，前者僅用一種染料，只

能觀察形態(tài)和排列，后者可鑒別細菌及某些特殊結(jié)構(gòu)。

1、1、1單染色法

1、1、1、1染液：呂氏亞甲藍染液或稀釋石炭酸復(fù)紅液。

1、1、1、2方法：

操作過程為：涂片一干燥一固定一染色一水洗一干燥一鏡

檢。

a、涂片：取清潔無油的載玻片一塊，在玻片中央滴一滴無

菌水或無菌生理鹽水（如用菌液，則不必加水）。以接種環(huán)挑取

菌落或待檢物，與水充分混勻制成薄涂片（約lcn?的薄層），切

勿濃厚。若是液體待檢物挑取2?3環(huán)直接涂抹即可。如同時在

一張載玻片上制作多個涂抹時，可在玻片反面用記號筆劃格編

號，在每一小格內(nèi)各制作一涂抹，接種環(huán)用畢應(yīng)立即在火焰上滅

菌。

b、干燥：在室溫中自然風(fēng)干，或置37c培養(yǎng)箱內(nèi)待干。

c、固定：除作莢膜和鞭毛染色外，均可用火焰固定，迅速

殺死菌體，并使菌體固定在玻片上。即將標本的一面朝上，迅

速通過火焰2?3次，使其受熱固定。受熱溫度不可過高，以手

觸及玻片背面，以不燙手為宜，溫度過高，影響染色效果。有的

不能用加熱固定，可改用固定液固定。

d、染色：用呂氏亞甲藍染液（或稀釋石炭酸復(fù)紅染液）1?

2滴，覆蓋涂抹，染1?2分鐘，傾去染液。

e、水洗：斜置玻片用很細水流的自來水自染色標本的上端

流下，勿使水流直接沖刷在涂片處，直至洗下的水呈無色為止。

f、干燥：已染色好的片子，自然風(fēng)干或用吸水紙輕輕印在

涂片處將水吸干。

g、鏡檢：置顯微鏡下，先用低倍鏡找準目標，于涂抹處滴

加香柏油一滴，用油鏡檢查。

1、1、2革蘭染色法：

革蘭染色法是一種極有價值的分類染色法，通過染色，可將

全部細菌分成兩大類一革蘭陽性菌和革蘭氏陰性菌。關(guān)于染色的

機制，與細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成密切相關(guān)。革蘭氏陽性菌的細胞壁

中肽聚糖含量最高（30%?60%）,脂含量低（1%?4%）,經(jīng)乙醇或

丙酮處理后脫水，可引起肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，以

至甲紫與碘的復(fù)合物可保留在菌體內(nèi)，不被脫去而顯藍紫色。革

蘭氏陰性菌的細胞壁中脂類物質(zhì)含量較高（11%?22%）,肽聚糖

含量低（約10%）,用乙醇或丙酮處理時，脂類物質(zhì)被溶解，使

細胞壁的通透性增大，以至結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物脫出細胞外，故

可被沙黃復(fù)染液著色而顯紅色。

1、1、2、1染液：

a、甲紫染液：取結(jié)晶紫2.0g,溶解于20ml95%乙醇中；再

取草酸鏤0.8g,溶解于80ml蒸儲水中；兩液混合靜置48h后使

用。此染液較穩(wěn)定，在密閉的棕色瓶內(nèi)可儲存數(shù)月。

b、革蘭碘液：取碘化鉀2g,以5?10ml蒸播水充分溶解

后，加碘1g,待完全溶解后，加水至300mL此染液較穩(wěn)定，在

密閉的棕色瓶內(nèi)可儲存數(shù)月。

c、脫色液：95%乙醇、或95%乙醇7份與丙酮3份混合液。

d、番紅復(fù)染液：0.25%番紅（沙黃）乙醇液。

取番紅（沙黃）0.25g,溶于10ml95%乙醇中，待完全溶解

后，再加蒸儲水稀釋至100ml。

1、1、2、2方法：

操作過程：涂片一干燥一固定一結(jié)晶紫染色一水洗一碘液媒

染一水洗一吸干一95%乙醇脫色一水洗一吸干一番紅復(fù)染一水

洗一干燥一鏡檢。

a、涂片：操作同單染色法。

b、干燥：操作同單染色法。

c、固定：操作同單染色法。

d、甲紫染色：將甲紫染液滴加在已固定的涂片上，覆蓋涂

抹，染Imin。

e、水洗：斜置玻片，用很細水流的自來水，自染色標本的

上端流下，勿使水流直接沖刷到涂抹處，直至流下的水呈無色為

止。

f、碘液媒染：滴加革蘭碘液作用Imino

g、水洗、吸干：水洗同上，瀝干。

h、脫色：滴加95%乙醇（或95%乙醇與丙酮混合液）脫色,

側(cè)動玻片，至無紫色脫落為止（約20?30秒）。

i、水洗：同單染色法。

j、吸干：瀝干、或用吸水紙輕輕印在涂抹處，將水吸干。

k、番紅復(fù)染：滴加番紅染液復(fù)染30s?Imin。

1、水洗：操作同單染色法。

m、干燥：操作同單染色法。

n、鏡檢：操作同單染色法。

1、1、2、3注意事項：

a、待檢菌菌齡應(yīng)為18h?24h。一般情況下，革蘭氏陰性菌

的染色反應(yīng)較穩(wěn)定，不易受菌齡長短影響；而革蘭氏陽性菌，有

的在幼齡時呈陽性，超過24h可變?yōu)殛幮?。故培養(yǎng)物越陳舊，菌

細胞衰老、死亡，則染色常為陰性，造成錯判。

b、涂片以勻薄為佳，切不可濃厚。過于密集的菌體，因洗

脫不勻常呈假陽性。鏡檢革蘭染色反應(yīng)時，要以分散開的細菌著

色為準。涂片后不宜用火焰烤干，宜自然干燥；若經(jīng)火焰固定時,

應(yīng)以溫?zé)岵粻C手為宜，以免菌體受損，致使染色反應(yīng)應(yīng)不準。

c、革蘭染色操作的關(guān)鍵步驟是脫色的掌握，脫色時間不足,

革蘭氏陰性菌可染成陽性菌；脫色過度，革蘭氏陽性菌可染成陰

性菌。故應(yīng)注意掌握，以無紫色脫出時立即水洗。脫色時間按涂

抹厚薄、涂片含水量多少適當掌握。涂抹厚，涂片含水少

（水洗后瀝干水分）時，脫色時間稍長；涂抹薄，涂片含水量多

時，脫色時間稍短，在20?30s內(nèi)調(diào)整。

d、碘液配制后，應(yīng)裝在密閉的棕色瓶內(nèi)儲存，如因儲存不

當，部分碘將被揮發(fā)或被還原，試液由原來的紅棕色變?yōu)榈S色,

以至影響甲紫的作用，故不宜再用。

e、革蘭染色能否獲得滿意的結(jié)果，與操作者的經(jīng)驗有很大

的關(guān)系。操作沒有把握或?qū)θ疽河袘岩蓵r，應(yīng)以對照菌同時染色。

方法是在一張載玻片上分三段涂片，中段作待檢菌涂片，一端作

革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌涂片，另一端作革蘭氏陰性菌大腸

埃希氏桿菌涂片，同一染色步驟，染色后鏡檢。如對照菌染色反

應(yīng)準確，則待檢菌的染色反應(yīng)準確。

1、1、2、4革蘭染色的結(jié)果

通過革蘭染色，可將細菌分為兩大類：革蘭氏陽性菌，鏡檢

菌體呈藍紫色；革蘭氏陰性菌，鏡檢菌體為紅色。此外，也可以

觀察細菌的個體形狀、大小、芽抱的有無（芽抱囊呈藍色或紅色,

芽抱囊內(nèi)的芽抱為無色透明的空白部分，游離的芽抱可著上藍紫

色或紅色的圈）以及芽抱形狀、大小、著生的位置等。

2、微生物的生化試驗

部門：質(zhì)保部題目：微4二物的生化試驗共13頁

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2、1概述

微生物在代謝過程中，由于各自獨特的酶系統(tǒng)，其分解與合

成代謝的產(chǎn)物各不相同。這些代謝產(chǎn)物各具不同的生化性質(zhì)利用

生物化學(xué)的方法測定這些代謝產(chǎn)物、代謝方式、條件等來鑒定細

菌的類別、屬種、稱為生化試驗。

2、1、1范圍：藥品微生物學(xué)檢驗細菌鑒定的生化試驗，包

括：糖代謝試驗；氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗；氨源與碳源的利用

試驗；酶試驗；其他試驗。

2、1、2方法：目前在藥品微生物學(xué)檢驗中，廣泛應(yīng)用的主

要仍是常規(guī)方法。這些方法，大體歸納為如下兒種類型。

2、1、2、1在培養(yǎng)基中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種，

培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)的PH值變化。例：各種糖、醇發(fā)酵試驗、甲基

紅試驗和尿素酶試驗。

2、1、2、2在培養(yǎng)物（或培養(yǎng)基）中加入試劑，觀察它們

同細菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。例如乙酰甲基甲醇生成（V

-P）試驗、靛基質(zhì)試驗。

2、1、2、3根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在，例氧

化酶試驗和血漿凝固酶試驗。

2、1、2、4根據(jù)細菌對理化條件和藥品試劑的敏感性，觀

察細菌的生長情況，如氟化鉀試驗，溫度生長試驗。

2、1、3生化試驗注意事項

2、1、3、1待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物，純培養(yǎng)物系單一菌細

胞繁殖的后代，因此待檢菌必須是取自經(jīng)過分離，純化的培養(yǎng)物。

否則，所觀察的生化反應(yīng)可能是兩種或多種菌的混合反應(yīng)，造成

試驗紊亂，無法得出正確的鑒定結(jié)果。因此，當生化試驗結(jié)果紊

亂時，應(yīng)重新分離，純化菌株后，再做試驗。

2、1、3、2待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物：生化試驗的待檢菌，

最好采用18-24hrs的新鮮培養(yǎng)物，此時細菌群體細胞的生理特

征比較一致。培養(yǎng)時間過長或陳舊的培養(yǎng)物，細胞衰退，生理特

征也會發(fā)生改變。常可影響鑒定結(jié)果的準確性。

2、1、3、3嚴格遵守觀察反應(yīng)的時間：觀察生化反應(yīng)結(jié)果

的時間，應(yīng)根據(jù)試驗項目的要求確定并嚴格遵守。藥品微生物檢

驗方法中規(guī)定的生化試驗觀察結(jié)果的時間，多為24或48hrs,這

是根據(jù)一般實際情況確定的，時間過短或過長，不能觀察到正確

結(jié)果。觀察試驗反應(yīng)結(jié)果，往往需加入試劑，加入試劑的時間也

應(yīng)根據(jù)各試驗的具體要求，注意掌握，不適時地（反應(yīng)物尚未出

現(xiàn)或者消失）加入試劑，就不會得出正確的結(jié)果。但反應(yīng)物出現(xiàn)

的時間常受到許多條件的影響（如培養(yǎng)基原料、制備方法、接種

量等），加入試劑的時間很難強求一致，因而必須按照各試驗的

規(guī)定要求，適時加入。

2、1、3、4應(yīng)做必要的對照試驗：培養(yǎng)基，試劑和試驗方

法等，可直接影響試驗結(jié)果。故每批培養(yǎng)基配成后，均應(yīng)以陽性

及陰性菌株測試，符合要求時，方可用于正式試驗。對一些反應(yīng)

不夠確定，或影響因素甚多的試驗，須在每次試驗的同時，

做陽性和陰性菌株對照試驗。

2、1、3、5注意提高陽性檢出率：為了提高檢出率，至少

應(yīng)以2—3個待檢的疑似菌落，分別進行試驗。菌落挑取數(shù)愈多,

陽性檢出率相對愈高。

2、2常用的生化試驗方法

2、2、1糖（醇）代謝試驗

2、2、1、1甲基紅試驗（M）

腸桿菌科細菌均可發(fā)酵葡萄糖，在磷酸鹽葡萄糖蛋白陳水培

養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)過夜后，均可發(fā)酵產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基

PH下降，故最初均可使甲基紅試劑變色而呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，但繼

續(xù)培養(yǎng)后，不同種屬的腸道菌便會出現(xiàn)不同的情況：甲基紅試驗

陽性菌產(chǎn)生更多的酸，并克服培養(yǎng)基中磷酸鹽的緩沖作用，使培

養(yǎng)液的PH值下降至4.5或更低，而甲基紅試驗陰性菌則進一步

代謝，使發(fā)酵產(chǎn)物通過脫竣作用產(chǎn)生中性乙酰甲基甲醇，結(jié)果使

培養(yǎng)液最終PH回升至接近中性（PH5.4以上）。大腸埃希氏桿菌

及其他甲基紅試驗陽性菌在試驗中產(chǎn)生大量的酸：乳酸、琥珀酸、

醋酸和甲酸，保持高氫離子濃度，故甲基紅試驗為陽性反應(yīng)。產(chǎn)

氣桿菌等菌也產(chǎn)酸，由于中性乙酰甲基甲醇形成，故生成的酸類

較少，甲基紅試驗為陰性反應(yīng)。

A、試劑：甲基紅指示劑。

B、培養(yǎng)基：磷酸鹽葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。

C、方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖

蛋白陳水培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)2—5天，48hrs取出部分培養(yǎng)

液，按每ml培養(yǎng)液加指示劑一滴的量加入甲基紅指示劑，立即

觀察結(jié)果，呈紅色或桔紅色，為陽性反應(yīng)；呈桔黃色或黃色為陰

性反應(yīng)，若為陰性反應(yīng)，余下的培養(yǎng)液應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至5天，再加

指示劑測定。

D、注意事項：

a、培養(yǎng)時間應(yīng)不少于48hrs,過早地滴加指示劑，常不能得

出正確結(jié)果。

b、培養(yǎng)基中蛋白陳可影響試驗結(jié)果。對配就的培養(yǎng)基，應(yīng)

用甲基紅陽性菌利陰性菌做對照試驗。

C、加入甲基紅指示劑后，應(yīng)立即觀察結(jié)果，放置過久，紅

色會消退。

2、2、1、2乙酰甲基甲醇生成試驗（V—P試驗）

細菌發(fā)酵葡萄糖生成丙酮酸，某些細菌可使丙酮酸脫竣形成

乙酰甲基甲醇。在堿性溶液中，乙酰甲基甲醇可被空氣中的氧氣

氧化成二乙酰（丁二酮）。二乙酰再與蛋白豚中精氨酸的股基作

用，生成紅色化合物。在培養(yǎng)基或試劑中加入精氨酸或肌酸，肌

酊可增加股基含量，試驗中加入a蔡酚是作催化劑，使反應(yīng)的顏

色增強，提高反應(yīng)的敏感性。

A、培養(yǎng)基：磷酸鹽葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基

B、試劑：

6%a—蔡酚乙醇溶液，40%氫氧化鉀（或40%氫氧化鈉）

C、方法：取待檢菌的新鮮培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋

白陳水培養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)48hrs,于每2nli培養(yǎng)液中加入

a一蔡酚乙醇試液1ml,混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml充

分搖搖，在4小時內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，黃色（與試劑顏色相同）

或出現(xiàn)類似銅色為陰性反應(yīng)。

D、注意事項：

a、陽性反應(yīng)必須在與空氣充分接觸的情況下完成。故加入

試劑后必須充分振搖，方可促使反應(yīng)出現(xiàn)。

b、加入試劑的須序不能顛倒，須首先加入a—茶酚試液再

加入氫氧化鉀試液，否則，可能產(chǎn)生假陰性或弱陽性反應(yīng)，加入

40%氫氧化鉀液量要準確，不可多加，否則，它可能與a—蔡酚

反應(yīng)出現(xiàn)銅色，不易與弱陽性反應(yīng)區(qū)分。

C、一般情況下，本試驗與甲基紅試驗呈相反結(jié)果，VP陽性

菌，甲基紅試驗為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細菌有的并無此

規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌，常VP試驗和甲基紅

試驗同時為陽性。

2、2、1、3MUG葡萄糖醛酸甘酶試驗：

細菌的葡萄糖醛酸甘酶在堿性條件下，作用于-4一甲基傘形

酮一B-D葡萄糖醛甘（MUG）的B葡萄糖醛酸甘鍵，使其水解,

釋放的4一甲基傘形酮在365nm紫外線燈下產(chǎn)生藍白色熒光。

97%的大腸埃希氏桿菌，10%的沙門菌以及少量的志賀菌具有葡

萄糖醛酸甘酶。中國藥品生物制品檢定所組織測試不同來源的

591株大腸埃希氏桿菌，MUG陽性率為94.7%。

A、培養(yǎng)基：MUG培養(yǎng)基。

B、方法：取待檢菌的固體培養(yǎng)物，或膽鹽乳糖增菌液或營

養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.2mL接種至MUG培養(yǎng)基中，置36±1℃培養(yǎng)5

—24hrs,分別于5小時■與24小時時，將培養(yǎng)管置365nm紫外燈

下約5cm處，以未接種培養(yǎng)物的MUG培養(yǎng)基管作空白對照，觀

察有無藍白色熒光?？瞻讓φ展軕?yīng)無藍白色熒光，試驗管出現(xiàn)藍

白色熒光為陽性反應(yīng)，反之為陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于

MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為靛基質(zhì)試驗陽性，呈試劑本色為

靛基質(zhì)試驗陰性。

C、注意事項：

a、試驗用試管和培養(yǎng)基應(yīng)事先檢測，在365nm上紫外燈下

無熒光產(chǎn)生者，方可使用。

b、本試驗與靛基質(zhì)試驗可同時測定，即觀察熒光后再加入

靛基質(zhì)試液觀察靛基質(zhì)反應(yīng)，若皆為陽性反應(yīng)即可判定待檢菌為

大腸桿埃希氏桿菌。

2、2、2氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗。

2、2、2、1靛基質(zhì)試驗（I）

含有色氨酸酶的細菌，能分解蛋白陳中的色氨酸形成靛基質(zhì)

（口引喙）。靛基質(zhì)無色，當加入對二甲氨基苯甲醛試劑后，形成

可見的紅紫色醍式化合物，即玫瑰靛基質(zhì)。本試驗常用于腸桿菌

種屬鑒別，大腸埃希氏桿菌98%為陽性反應(yīng)，產(chǎn)氣克霉伯菌，沙

門菌為陰性反應(yīng)。

A、試劑：靛基質(zhì)試液（柯凡克試劑）

B、培養(yǎng)基：胰蛋白陳水培養(yǎng)基

C、方法：取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種至胰蛋白陳水培

養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)24—48hrs,沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，

液面呈玫瑰紅色為陽性反應(yīng)，無紅色為陰性反應(yīng)。

D、注意事項：

a、所用蛋白陳應(yīng)含有豐富的色氨酸。胰蛋白陳中色氨酸含

量較高，故宜選用。

b、靛基質(zhì)試液應(yīng)密閉于棕色瓶中，冰箱保存。放置過久顏

色變深，不宜適用。試劑的質(zhì)量，應(yīng)以已知陽性及陰性菌測試。

c、色氨酸酶活性的最適PH為7.4?7.8,PH降低，靛基質(zhì)產(chǎn)

生減少，可能出現(xiàn)假陰性或弱陽性反應(yīng)，故培養(yǎng)基應(yīng)為7.4?7.6。

不宜用含葡萄糖的培養(yǎng)基進行試驗，因產(chǎn)生靛基質(zhì)的細菌都能發(fā)

酵糖類，致使培養(yǎng)基酸度增加。

d、為加強顏色反應(yīng)，可于培養(yǎng)液中加1ml乙醛或二甲苯，

搖勻，使靛基質(zhì)提取至其中，待乙酸（或二甲苯）浮至液面，再

加入靛基質(zhì)試液。

e、在培養(yǎng)24hrs觀察結(jié)果時，宜先取出2ml培養(yǎng)液謫加靛

基質(zhì)試液觀察，若為陰性再繼續(xù)養(yǎng)至48hrs再檢查。

2、2、2、2明膠液化試驗：

明膠是一種膠原蛋白，不具有?般蛋白質(zhì)加熱凝固的特性，

其水溶液在24c以下為凝固狀態(tài)。明膠可被細菌的膠原酶（蛋

白分解酶）分解為氨基酸，分解后的明膠，凝固力降低。低于

20℃時不再凝固，呈液化狀態(tài)。

本試驗為細菌鑒定的常規(guī)試驗法。銅綠假單胞菌、熒光假單

胞菌，腐敗假單胞菌等為陽性反應(yīng)，腸桿菌科細菌很少液化明膠

（陰性）。

A、培養(yǎng)基：明膠培養(yǎng)基

B、方法：用接種針取待檢菌純培養(yǎng)物，穿刺接種于明膠培

養(yǎng)管內(nèi)，于36℃培養(yǎng)24hrs,取出置冰箱內(nèi)10?30分鐘，觀察結(jié)

果，如明膠呈液體狀態(tài)為陽性反應(yīng)，呈凝固狀態(tài)為陰性反應(yīng)。

C、注意事項

a、明膠的質(zhì)量與用量試驗影響很大，以能在20c時凝固成

穩(wěn)定膠凍者為佳，培養(yǎng)基試驗時，應(yīng)分別用陽性菌株對照。

b、明膠在20℃以下時為固體，而在35℃以上時為液體，故

經(jīng)培養(yǎng)后判斷結(jié)果，必須先放在冰箱內(nèi)冷卻一段時間。觀察結(jié)果

時，當培養(yǎng)基還處于溫?zé)釥顟B(tài)時，切勿搖動，否則培養(yǎng)基表層的

液化現(xiàn)象，可被其與培養(yǎng)基混合而被掩蓋，造成假陰性。

2、2、3碳源和氮源利用試驗

2、2、3、1枸椽酸鹽利用試驗（C）：

枸椽酸鹽培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基，不含蛋白豚和糖類，枸椽酸

鈉是唯一碳源，磷酸二氫鐵為無機鏤鹽。能利用枸椽酸鹽作為碳

源的細菌，同樣也能利用鏤鹽作為唯一氮源，可在枸椽酸鹽培養(yǎng)

基上生長，枸椽酸鈉被分解成碳酸鈉與水，使培養(yǎng)基PH值升高,

漠麝香草酚藍指示劑顯藍色。

本試驗主要用于腸桿菌科細菌鑒定。埃希氏菌屬，志賀菌屬,

愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常

為陽性、枸椽酸桿菌利某些變形桿菌陽性。止匕外，銅綠假單胞菌,

洋蔥假單胞菌和嗜水氣單胞菌亦為陽性。

A、培養(yǎng)基：枸椽酸鹽培養(yǎng)基。

B、方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于枸椽酸鹽培養(yǎng)

基上，于36℃培養(yǎng)48?72小時，培養(yǎng)基斜面有菌落生長，培養(yǎng)

基由綠色變?yōu)樗{時為陽性反應(yīng)，無菌落生長，斜面仍為綠色為陰

性反應(yīng)。

C、注意事項

a、為防止其他培養(yǎng)基成分混入本培養(yǎng)基中導(dǎo)致假陽性，應(yīng)

注意在制備培養(yǎng)基前，將瓊脂用流水沖洗3天，再用蒸儲水洗凈

烘干備用；在接種時宜將培養(yǎng)物制成生理鹽水懸液接種；用同一

培養(yǎng)物接種一組生化管時，宜先接種本培養(yǎng)基，接種其他培養(yǎng)基

后一定要用火焰滅菌接種環(huán)，再接種本培養(yǎng)基。

b、制備培養(yǎng)基時，應(yīng)調(diào)整PH至規(guī)定值，若PH偏高，則與

陽性反應(yīng)結(jié)果混淆而不易判斷。

c、接種量應(yīng)適當，過少可發(fā)生假陰性，接種量過量時可導(dǎo)

致假陽性。

2、2、4酶類試驗

2、2、4、1氧化酶試驗：氧化酶或稱細胞色素氧化酶，是

細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終端呼吸酶，能直接利用氧分子作為受氫

體，將底物上脫下來的氫與氧結(jié)合成水。作氧化酶試驗時，此酶

并不直接與氧化酶試劑反應(yīng)，而是首先使細胞色素C氧化，然后

此氧化型細胞色素C再使對苯二胺試劑氧化，使之成為紅色到暗

紫色的醍式化合物，原法采用四甲基對苯二胺。

本試驗主要用于奈瑟球菌屬鑒別，區(qū)別假單胞菌科與氧化

酶陰性的腸桿菌科細菌。

A、試劑：1%;鹽酸二甲基對苯二胺溶液。

B、方法：取潔凈的濾紙塊置平皿內(nèi)，用細玻璃或細木棍挑

取新鮮待檢菌的菌苔或菌落少許，涂于濾紙上，滴加1%鹽酸二

甲基對苯二胺試液一滴（或先滴加試劑再涂菌苔），菌苔立即呈

現(xiàn)玫瑰紅色，繼而變深，并于30秒內(nèi)呈現(xiàn)深藍色為陽性反應(yīng)，

不變色為陰性反應(yīng)。

C、注意事項

a、有時菌苔（落）本身顯紅色，不易觀察反應(yīng)，可再滴加

l%a一蔡酚乙醇溶液1—2滴，如出現(xiàn)藍色，即可判斷陽性，出

現(xiàn)變色的時間要求與上述方法相同。

b、含葡萄糖培養(yǎng)基的菌落，不宜做氧化酶試驗，因葡萄糖

發(fā)酵可抑制氧化酶的活性，造成假陰性反應(yīng)。

c、待檢菌應(yīng)避免同鐵、鍥等金屬接觸，故不宜用銀信合金

絲制成的接種環(huán)（針）挑取菌苔（落）。

d、試驗菌落須新鮮，陳舊者反應(yīng)不可靠。

e、試劑宜新鮮配制，并儲存于密閉玻塞瓶中，如顏色變成

紅褐色，不可使用。

f、反應(yīng)需在有氧條件下進行，勿將試劑滴加過多，以免妨

礙菌苔與空氣接觸，造成假陰性。

g、二甲基對苯二胺鹽酸鹽亦稱對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽購

買時須注意。四甲基對苯二胺鹽酸鹽比二甲基對苯二胺鹽酸鹽更

為敏感，但價格昂貴且不穩(wěn)定，二甲基對苯二胺鹽酸試劑不論是

粉劑還是溶液，均很穩(wěn)定，可用于本試驗。

2、2、4、2硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗

有些細菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并將亞硝酸鹽進一

步分解為氮氣，觀察有無產(chǎn)氣現(xiàn)象即為硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗。本

試驗常用于鑒別銅綠假單胞菌和其他假單胞菌，前者為陽性反

應(yīng)。

a、培養(yǎng)基：硝酸鹽陳水培養(yǎng)基。

b、方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種至硝酸鹽陳水培

養(yǎng)基內(nèi)，置36℃培養(yǎng)24hrs觀察結(jié)果。在培養(yǎng)基的小倒管內(nèi)有氣

泡產(chǎn)生者，為陽性反應(yīng)；無氣泡產(chǎn)生者為陰性反應(yīng)。

c、注意事項：本試驗用培養(yǎng)基中加有亞硝酸鹽，并放置小

倒管專為觀察產(chǎn)氣反應(yīng)，與鑒定一般細菌用的硝酸鹽還原試驗培

養(yǎng)基不同，切勿混用。

2、2、4、3血漿凝固酶試驗。

血漿凝固酶是一種能使血漿凝固的酶類物質(zhì)。致病性葡萄球

菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著

于細菌表面，形成凝塊。葡萄球菌產(chǎn)生的凝固酶有兩種，一種是

與細胞壁結(jié)合的結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，

使發(fā)生沉淀，可用玻片法測出；另一種是由菌體生成釋放于培養(yǎng)

基中，叫做游離凝固酶，它能使血漿中凝固酶反應(yīng)因子（CRF）

形成類似凝血酶的物質(zhì)，間接地使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，

可由試管測出。

A、試劑：血漿

血漿制備:先將采血用注射器及針頭，含5%枸椽酸鈉的0.9%

氯化鈉溶液滅菌后備用。以無菌手續(xù)自家兔心臟采血9ml,迅速

加至裝有含5%枸椽酸鈉的0.9%氯化鈉溶液1ml的滅菌離心管

內(nèi)，充分混合數(shù)分鐘后，以1500轉(zhuǎn)/分離心15min分離血漿用

滅菌吸管取血漿移至滅菌試管中，置冰箱中備用。

注意：取血后應(yīng)及時分離血漿，已出現(xiàn)凝塊的血液，或發(fā)現(xiàn)

有纖維蛋白析出的血漿不可使用。制備好的血漿應(yīng)以陽性菌株測

試，并作空白對照，合格者方能使用。人血漿亦可采用。

B、方法：

a、玻片法（結(jié)合凝固酶）：取潔凈的載玻片一張，在玻片兩

端分別滴上滅菌生理鹽水和未經(jīng)稀釋的血漿各一滴。取待檢菌

18-24hrs肉湯培養(yǎng)液或瓊脂培養(yǎng)物一接種環(huán)，加至生理鹽水中，

制成濃菌懸液，再取此菌懸液一環(huán)，與血漿混合均勻，觀察結(jié)果。

在5min內(nèi)混菌的血漿出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而在鹽水中呈均

勻混濁時，即為陽性反應(yīng)。在血漿中呈均勻混濁時，則為陰性反

應(yīng)。同時做陽性菌利陰性菌對照試驗。

b、試管法（游離固酶）：取滅菌小試管3支，各加血漿一無

菌水（1：1）0.5ml,其中一支加入待檢菌生理鹽水懸液或肉湯

培養(yǎng)液0.5ml為試驗管；另一支加陽性對照菌生理鹽水懸液或營

養(yǎng)肉湯培養(yǎng)0.5ml作陽性對照管；再一支加生理鹽水或營養(yǎng)肉湯

培養(yǎng)基0.5ml作陰性對照管，三管同時放36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小

時后，每隔Ihrs觀察一次結(jié)果，觀察時不要振動或搖動試管，

輕輕將試管傾斜至橫放，檢查各管是否凝固或有凝塊，陰性對照

管應(yīng)無凝固或凝塊，陽性對照管應(yīng)凝固或有凝塊，試驗管出現(xiàn)凝

塊或明顯的纖維蛋白狀物為陽性，其中凝塊遍及整個試管為強陽

性，若4hrs時無凝塊或凝固現(xiàn)象，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至24hrs再行檢查,

若無凝固或凝塊判為陰性反應(yīng)。若陽性對照管無凝固或凝塊現(xiàn)

象，或陰性對照管出現(xiàn)凝固或凝塊，表明血漿不可靠，試驗結(jié)果

無效，應(yīng)重新制備血漿，再進行試驗。

C、注意事項

a、試管法和玻片法的結(jié)果可能不一致，玻片法僅是?個初

步檢驗方法，其陰性或可疑結(jié)果都必須做試管法來確定。

b、玻片法試驗時，待檢菌懸液以較濃者為宜，否則易出現(xiàn)

假陰性。

c、試驗時，待檢菌應(yīng)取自普通瓊脂或血瓊脂，含選擇性抑

菌劑的培養(yǎng)基易使葡萄球菌發(fā)生變異。

d、有些金黃色葡萄球菌菌株能產(chǎn)生大量纖維蛋白溶酶，使

出現(xiàn)的凝塊溶解，造成假陰性。故須每隔Ihrs觀察一次結(jié)果特

別是在接種后的前數(shù)小時。

e、待檢菌的培養(yǎng)物必須新鮮，陳舊的培養(yǎng)物（超過24hrs）

或生長不良的細菌，凝固酶活性低，可能測不出。

2、2、4、4綠膿菌素試驗

銅綠假單胞菌能產(chǎn)生一種綠色的水溶性色素，這種色素能擴

散到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色，并根據(jù)其溶解于氯仿而被提

取，遇酸呈紅色的特性得到證明。本試驗對鑒別銅綠假單胞菌與

其他假單胞菌具有重要價值，銅綠假單胞菌以綠膿菌素為其特征

反應(yīng)，而其他細菌無。

A、培養(yǎng)基：綠膿菌素測定用培養(yǎng)基。

B、試劑：氯仿，鹽酸(lmol/L)

C、方法：取待檢菌營養(yǎng)瓊脂新鮮培養(yǎng)物，接種在綠膿菌素

用瓊脂斜面上，置36℃培養(yǎng)24小時，若出現(xiàn)綠色，在試管內(nèi)加

氯仿3-5ml攪拌充分振搖，使培養(yǎng)物中的色素提取在氯仿液中，

待氯仿提取液呈藍綠色時，用毛細吸管將其轉(zhuǎn)至另一試管中，并

在該液中加鹽酸約1ml振搖后靜置片刻，上層鹽酸液中呈現(xiàn)粉紅

色，即為陽性反應(yīng)，無粉紅色出現(xiàn)陰性反應(yīng)。

D、注意事項

a、綠膿菌素為銅綠假單胞菌特征性產(chǎn)物，但亦有不產(chǎn)生綠

膿菌素者，故不能以本試驗陰性作為否定銅綠假單胞菌的唯--依

據(jù)。

b、綠膿菌素的產(chǎn)生除菌株差異外，與培養(yǎng)基成分密切相關(guān),

如蛋白豚、瓊脂及化學(xué)試劑，其品牌需事先經(jīng)測試后選用。

2、2、4、541℃生長試驗

細菌在一定的溫度范圍內(nèi)才能進行其生命活動，不同種屬的

細菌，其生長溫度不盡相同，假單胞菌屬中的一些種，如銅綠假

單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌、類鼻疽假單胞菌等能在41℃生長，而

熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌等其他假單胞菌屬細菌則不能生

長。設(shè)定41c溫度進行培養(yǎng)，便可將他們區(qū)別開來。

A、培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂斜面。

B、方法：取待檢菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物一接種環(huán)，接種于營養(yǎng)

瓊脂斜面，立即置于事先已調(diào)控至41c水浴中培養(yǎng)24—48hrs,

觀察斜面有無菌苔生長，生長者為陽性反應(yīng)；未生長者為陰性

反應(yīng)。

C、注意事項

a、所用溫度計應(yīng)事前標定。

b、接種后立即置于41℃水浴箱中，水浴箱液面應(yīng)浸沒整個

斜面的試管部分。水浴能在最短時間內(nèi)使培養(yǎng)基與水溫平衡，較

之電熱培養(yǎng)箱為好，特別在冬季。

3、微生物限度檢查法

部門：質(zhì)保部題目：微4E物限度檢查法共33頁

編號：Q/Cr-JS1403—2012新訂：替代：V起草：

日期：

部門審閱：QA審閱：批準：執(zhí)行日期：

日期：日期：日期：

頒發(fā)部門：分發(fā)部門：質(zhì)保部、中心化驗室頒發(fā)份數(shù)：份

微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微

生物污染程度的一種檢查方法。檢查項目包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、

酵母菌數(shù)及控制菌檢查。

微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度C級背景下的A級單向流

空氣區(qū)域進行。

供試品應(yīng)隨機抽樣，如遇異?；蚩梢傻臉悠罚仨毴∮幸闪x

的樣品，一般抽樣量為檢驗用量（2個以上最小包裝單位）的3

倍量，供試品在檢驗前不能開啟，在檢查前及檢查中應(yīng)防止供試

品污染菌受損、致死或繁殖。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶

口周圍）外觀看出發(fā)霉、變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無需

再抽樣檢查。

檢查的全過程均應(yīng)嚴格遵守?zé)o菌操作，嚴防再污染。

除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30?

35℃,霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23?28℃。細菌、霉菌（酵母

菌）計數(shù)和控制菌檢查，均應(yīng)做對照試驗。

檢驗結(jié)果的報告以lg、1ml、10g、10ml或lOcn?為單位報

告，特殊品種可以最小包裝單位報告。

3、1供試品的檢驗量

每批供試品檢驗量一般為10g或10ml,且均須取自2個以

上的包裝單位。

3、2供試品的取樣

3、2、1散劑

3、2、1、1取兩袋以上包裝，拭擦外表并經(jīng)紫外線照射后,

轉(zhuǎn)入無菌室。

3、2、1、2在開袋前，將各包裝顛倒混合，使內(nèi)部藥物混

勻。

3、2、1、3用碘酊及75%乙醇擦拭各袋開口處。

3、2、1、4剪開袋口，從各袋中取出部分樣品，置無菌稱

量紙上，稱取10g作為供試品。

3、2、2軟膏劑、凝膠劑

3、2、2、1取兩支以上供試品包裝單位，擦試外表并經(jīng)紫

外線燈照射后，轉(zhuǎn)入無菌室。

3、2、2、2用碘酊及75%乙醇消毒管口區(qū)域外表。

3、2、2、3用無菌剪刀剪除封口。

3、2、2、4將管內(nèi)藥物擠出適宜滅菌的容器內(nèi)，另將軟管

置天平盤上先行稱量再用減量法計量，亦可將容器置天平盤上除

重后再稱量，稱取10g供試品。

3、2、3洗劑

3、2、3、1取兩瓶（袋）以上供試品包裝單位，擦試外表

并經(jīng)紫外線燈照射后，轉(zhuǎn)入無菌室。

3、2、3、2用碘酊及75%乙醇消毒瓶口區(qū)域外表。

3、2、3、3用無菌剪刀剪除封口。

3、2、3、4將瓶（袋）內(nèi)藥物擠出適宜置滅菌的容器內(nèi)，

用增量法稱取10g供試品。

3、2、4栓劑

3、2、4、1取20顆以上供試品包裝單位，擦試外表并經(jīng)紫

外線燈照射后，轉(zhuǎn)入無菌室。

3、2、4、2用碘酊及75%乙醇消毒瓶口區(qū)域外表。

3、2、4、3用無菌剪刀剪除封口。

3、2、4、4將泡罩內(nèi)藥物擠出適宜置滅菌的容器內(nèi)，用增

量法稱取10g供試品。

3、2、5原輔料

原輔料與制劑不同，數(shù)量多，包裝大，應(yīng)參照有關(guān)規(guī)定抽樣。

大包裝原輔料按件計量，不以批量計，檢驗量仍按10g或10ml

取量。

在抽取樣品時，應(yīng)保證抽樣供試品及大包裝原輔料樣品不受

污染。無菌原料須在嚴格的無菌條件（無菌抽樣間）下取樣，所

用器具須經(jīng)滅菌并須無菌操作。

3、3稀釋劑

各劑型及原輔料的供試樣品，一般均需用稀釋劑處理后作為

供試液。常用稀釋劑有：

3、3、10.9%無菌氯化鈉溶液：

配制：稱取氯化鈉9g溶于1000ml蒸儲水中，分裝每瓶

300?400ml,于121c高壓蒸汽滅菌20min,備用。

3、3、2PH6..8無菌磷酸鹽緩沖液

配制：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL加0.2mol/L的氫

氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml,搖勻，過濾，分裝，滅菌。

3、3、3PH7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液

配制：稱取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉

4.30g、蛋白月東1.0g,加水1000ml,微溫溶解,濾清,分裝，滅菌。

3、4供試液的制備

按供試品的理化特性與生物學(xué)特性可采取適宜的方法制成

供試液。

3、4、1散劑供試品（足光散）供試液的制備。

以無菌操作稱取樣品10g,直接置于含玻璃珠若干粒的

250?300ml滅菌錐形瓶中，加稀釋劑100ml,充分振搖均勻，必

要時借助保溫（不超過45℃）助溶。

3、4、2軟膏劑、凝膠劑供試品供試液的制備

本公司軟膏劑、凝膠劑，其基質(zhì)均是水溶性的，能與稀釋劑

均勻混合，以無菌操作取樣10g,置于含玻璃珠若干粒的250-

300ml錐形瓶中，加稀釋劑100ml,充分搖勻即可。

3、4、3洗劑供試品（復(fù)方酮康晚發(fā)用洗劑）供試液的制備

以無菌操作取樣10g,置于含玻璃珠若干粒的250-300ml

錐形瓶中，加稀釋劑100ml,充分搖勻即可。

3、4、4栓劑供試品供試液的制備

稱取供試品10g,置滅菌錐形瓶中，加適量PH7.0無菌氯化

鈉-蛋白豚緩沖液,置45c水浴保溫10分鐘，使溶，加入無菌聚山

梨酯805?8m1,振搖使之乳化，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白豚

緩沖液（稀釋劑和聚山梨酯80總量為100ml），搖勻。

3、5細菌數(shù)的測定

3、5、1平皿菌落計數(shù)法

3、5、1、1設(shè)備、儀器、器皿及用具。

a、設(shè)備

凈化工作臺，恒溫培養(yǎng)箱（30—35℃）,恒溫水浴，電熱干

燥箱（250-300℃）,電冰箱、空調(diào)、高壓蒸汽滅菌器。

b、儀器、器皿

顯微鏡（1500X）、電子天平或藥物天平（感量0.1g）.酸

度計。

錐形瓶（250-300ml,或內(nèi)裝玻璃珠若干），研缽（陶瓷制

直徑10-12cm）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml）、試管（18mmX18m量

及塞、吸管（1ml分度O.OKlOml分度0.1）、注射器（20或30ml）、

注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）。

玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管上端距

0.5cm處塞入約2cm左右的適當疏松棉花，裝入吸管筒內(nèi)或牛皮

紙口袋中。錐形瓶、量筒、試管均加棉塞或硅氟料塞，若用振蕩

器制備混懸液時，尚需用玻璃紙包裹瓶塞（以免振蕩時供試液污

染瓶塞），再用牛皮紙包扎。玻璃器皿均于160C干熱滅菌2hrs

或高壓蒸汽滅菌121℃20min、烘干備用。

c、用具

大、小橡皮乳頭(置干凈帶蓋的容器中并應(yīng)定期用5%來蘇

溶液浸泡)；無菌衣、帽、口罩.、手套(洗凈后，配套，用牛皮

紙包嚴)滅菌，備用。

接種環(huán)、酒精燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌鑲

子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號

筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋(12cm)、實驗記錄紙。

3、5、1、2培養(yǎng)基、稀釋劑。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

稀釋劑：ph7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液。

3、5、1、3操作步驟

a、試驗前的準備包裝

(1)將所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管

(1ml、10ml)、量筒，稀釋劑及供試品等移至無菌室內(nèi)。每次試

驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，避免操作中出入操作

間，將全部外包裝(牛皮紙)去掉，編號。

(2)開啟紫外線殺菌燈和空氣過濾裝置并使其工作30mino

操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外線殺菌燈，進入緩沖間，換

工作鞋。再用0.1%苯扎澳鍍消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴

無菌衣，帽、口罩、手套。

(3)操作前先用乙醇棉擦手，再用碘伏棉球或乙醇棉球擦試

供試品瓶、管、袋等開口處周圍。待干后用滅菌的手術(shù)剪刀將供

試品瓶、管、袋啟封、啟封后先檢查瓶蓋內(nèi)側(cè)及管口周圍有無生

霉、長螭的跡象，對肉眼可見疑似者，用放大鏡或顯微鏡觀察，

若經(jīng)證實為生霉、長螭即可判斷為不合格，無須繼續(xù)檢驗。

b＞操作

(1)供試品取樣見“3、2”。

(2)供試液的制備見“3、4”。

(3)供試液的稀釋(10倍遞增稀釋法)。

取3—4支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑。另取1ml

滅菌吸管吸取1：10均勻供試液1ml加入裝有9ml滅菌稀釋劑的

試管中，混勻即成1：100供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染

程度可稀釋至1：1()3、或1：10\一般取1：]0、1：1()2、[：

1()3三級稀釋液檢驗。每遞增1稀釋級，必須另換一支吸管。

(4)注平皿：

在進行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管吸取每級稀

釋液各1ml置每個滅菌平皿中，每稀釋級注2?3個平皿。另取1

支1ml吸管吸取稀釋劑各1ml注入2個平皿中，作為陰性對照。

(5)傾注培養(yǎng)基：

將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂)熔化，冷至約45℃時,

傾注上述各個平皿約15ml,以順時針或反時針方向快速轉(zhuǎn)動平

皿(勿使培養(yǎng)基溢出)，使供試液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。

(6)培養(yǎng)：將已凝固的平板倒置于30?35c培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)

3天。

(7)菌落計數(shù)：

將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼用標記

筆點計，以透視光襯以暗色背景，仔細觀察，計數(shù)。必要時借助

于放大鏡、菌落計數(shù)器和顯微鏡觀察。

細菌菌落形態(tài)特征：常為白色、灰白色或灰色、亦有淡褐色、

淡黃色(如培養(yǎng)基中加入0.1%TTC試劑，菌落為紅色)。

菌落邊緣整齊或不整齊。有放射狀、樹枝狀、鋸齒狀、卷

發(fā)狀。菌落表面有光滑、粗糙、皺折、突起或扁平。

菌落大小差別很大，同一平板上可出現(xiàn)針尖大小至大于

10mm菌落。外觀多樣，小而突起或大而扁平，或云霧狀，不規(guī)

則。

c、菌落數(shù)報告的規(guī)則

細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平

均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告(取兩位有效數(shù)

字)的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、

1ml或lOcn?供試品中所含的菌數(shù)。

如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有

菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的

值報告菌數(shù)。

3、5、2薄膜過濾法

3、5、2、1采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um,

直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)

的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的

充分被截留o濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時,

應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量

的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用

前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品

溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要

用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml.?？倹_洗量不

得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

3、5、2、2取相當于每張濾膜含1g、1ml或lOcn?供試品

的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、

1ml或10cm之所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml

進行試驗。用Ph7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液或其它適宜的沖

洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證:沖洗

后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)

基或酵母浸出粉豚葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至

少制備一張濾膜。

3、5、2、3陰性對照試驗取試驗用的稀釋液1ml,照上

述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

3、5、2、4培養(yǎng)和計數(shù)培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法,

每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100個。

3^5、2^5菌落報告規(guī)則以相當于1g、1ml或lOcm?

供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以VI報告菌

數(shù)（每張濾膜過濾lg、1ml或10cn?供試品），或＜1乘以稀釋

倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

附：培養(yǎng)基稀釋法：

取低稀釋供試液（原液或1：10供試液）2份，每份各1ml,

分別注入5個或5個以平皿中（每皿0.2ml或V0.2ml）,每個平

皿傾注營養(yǎng)瓊脂約15mL混勻，凝固后，倒置，30?35C,培養(yǎng)

72hrso

5個或5個以上的平板點計的菌落之和，即為每1ml菌落數(shù),

共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋

倍數(shù)報告。

3、5、3結(jié)果報告

3、5、3、1菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)據(jù)報告。

3、5、3、2菌落數(shù)大于100時，取兩位有效數(shù)字，第三位

按修約規(guī)則處理。

3、5、3、3復(fù)試

供試品細菌數(shù)一次檢驗不合格，應(yīng)重新取二倍量供試品，依

法做單項復(fù)試兩份，以三次結(jié)果的均值報告。若3次結(jié)果的平均

值不超過該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；否則，判供試

品不符合規(guī)定。

3、5、4注意事項

3、5、4、1培養(yǎng)基及其制備方法：

培養(yǎng)基的成分及原材料的選擇對細菌計數(shù)測定結(jié)果會造成

很大誤差，其中陳、瓊脂以及pH值對實驗影響較大，每次實驗

應(yīng)特別注意。制備培養(yǎng)基時應(yīng)注意：

a、培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如發(fā)生沉淀，應(yīng)趁熱過濾。

b、制備后的培養(yǎng)基應(yīng)及時滅菌，不應(yīng)放置，避免細菌繁殖。

c、培養(yǎng)基的分裝量一般不得超過容器具1/3,最多不超過

容器2/3,以免滅菌時溢出。

d、制備妥的培養(yǎng)基應(yīng)在冷暗處保存，放置時間不能過長。

錐形瓶裝的瓊脂培養(yǎng)基，保存時間最長不能起超過3星期，以免

水分散失及染菌。

e、已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，一般開啟后不宜再用，更

不要反復(fù)加熱熔化。

f、勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營養(yǎng)成分過度受熱

而破壞最好用微波爐熔化瓊脂培養(yǎng)基,其優(yōu)點是受熱均勻、方便、

省時。

3、5、4、2操作技術(shù)

a、供試品檢驗過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用滅菌用具

時，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不能用口吹吸。

b、如在無菌室操作，使用乙醇燈時，切勿在火焰正上方操

作，以免將供試品內(nèi)細菌殺死。

c、在凈化工作臺上操作時，應(yīng)避免雙手來回出入工作臺，

而在無菌室操作時，應(yīng)避免操作者來回出入無菌室。

d、不溶于水的供試品必須助溶后再進行試驗，以免造成實

驗誤差。

e、供試品稀釋時，注意每一稀釋度換1支吸管（原吸管不

要吹洗）。

f、使用滅菌吸管時，管尖不要接觸可能污染的任何容器（瓶

口、試管口）或用具。

g、在做10倍遞增稀釋時，吸管插入稀釋液內(nèi)不低于2.5cm,

反復(fù)沖洗10次，吸液高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管貼

于容器內(nèi)壁吸取1ml。靠近液面（但勿接觸液面）緩緩地吹出全

部供試液至第二個容器中（即第一級稀釋液所用吸管勿接觸第二

級稀釋液）。將吸管放入消毒筒內(nèi)。

h、經(jīng)驗證明，兩級稀釋與兩個平板多不能如實反映染菌量,

誤差較大。宜采用三三制，即稀釋三級。每級稀釋液采用三個平

皿。

i、取供試液注平皿時，要取均勻的供試液。如取上清液或

沉淀物對試驗結(jié)果必然有影響。

j、注皿時培養(yǎng)基應(yīng)在45±1℃,高于45c時易造成細菌受

損或致死，低于45℃易凝固，影響混勻，因此使用前可用水浴

保溫效果較好。

m、傾注培養(yǎng)基于平皿中與樣品搖勻時，切勿濺到皿蓋邊和

皿蓋上，以免影響實驗結(jié)果。

n、從供試品稀釋，注平皿，傾注培養(yǎng)基，全部操作應(yīng)在Ihrs

內(nèi)完成，避免由于時間過長，導(dǎo)致細菌細胞繁殖或死亡。

3、5、4、3結(jié)果判斷

a、在進行菌數(shù)計數(shù)時，應(yīng)仔細觀察。勿漏計細小的，瓊脂

內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落，同時應(yīng)注意細菌菌落與供試品中顆

粒，沉淀物，氣泡等的鑒別。必要時用放大鏡或低倍顯微鏡直接

觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)別，可延長培養(yǎng)時間5-7

天，細菌菌落常會生長增大而加以鑒別。

b、供試品稀釋液中常含有不溶性原輔料，培養(yǎng)基注皿后亦

可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多難與菌落相鑒別

的有形物，為了方便菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的稀釋

液增加注皿1—2個，計數(shù)，或用0.001%TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)

培養(yǎng)后可將細菌菌落與其他有形物區(qū)別開來（菌落為紅色）。

c、如同一稀釋級二個平板菌落數(shù)超出一倍以上，不應(yīng)計數(shù),

菌落蔓延成片也不應(yīng)計數(shù)。

3、5、4、4異常情況處理。

a、菌落蔓延：培養(yǎng)基中，由于一些菌落蔓延生長而影響另

一些菌落生長，甚至掩蓋了另一些菌落，干擾計數(shù)。

細菌菌落蔓延生長主要原因是有動力（鞭毛）和培養(yǎng)環(huán)境濕

度過大造成，即平板表面濕度過大，給動力菌造成泳動的條件，

促使形成蔓延菌落機會增多。

防止菌落蔓延的方法如下：

①、加TTC：于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加

入滅菌1%TTC溶液1ml（最終濃度為0.001%,混勻后傾注平皿）。

②、開蓋干燥：將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置斜放于凈化

工作臺上，開機1—2小時后合蓋，再放入培養(yǎng)箱中。

③、換陶瓦蓋：將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的

陶瓦蓋。

b、異常菌數(shù)報告法：

一般情況下，以營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)細菌數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂平

板計數(shù)霉菌、酵母菌數(shù)。在特殊情況下，如營養(yǎng)瓊脂平板生長了

霉菌、酵母菌，且多于玫瑰紅鈉瓊脂平板的菌落數(shù)，則以營養(yǎng)瓊

脂平板的霉菌、酵母菌數(shù)報告；反之，如玫瑰紅鈉瓊脂平板生長

了細菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板的菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板

的細菌數(shù)報告。如營養(yǎng)瓊脂平板生長的霉菌、酵母或玫瑰紅鈉瓊

脂平板生長的細菌菌落超過該品種微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復(fù)試2

次，如3次結(jié)果的平均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判定供試品不合格。

3、6霉菌、酵母菌數(shù)的測定（平板菌落計數(shù)法）。

3、6、1設(shè)備、儀器、器皿及用具。

霉菌培養(yǎng)箱（或生化培養(yǎng)箱），其他設(shè)備、儀器、器皿及用

具與細菌數(shù)測定相同，但用生化培養(yǎng)箱代替霉菌培養(yǎng)箱時，由于

生化培養(yǎng)箱沒有保持箱內(nèi)濕度的功能，這對于霉菌、酵母菌的培

養(yǎng)有一定影響（一般霉菌在濕度低于75%時即不生長），因此，

應(yīng)在生化培養(yǎng)箱底部放置一小盤水，以保持一定的濕度。

3、6、2培養(yǎng)基、稀釋劑

培養(yǎng)基：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。

稀釋劑：ph7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液。

3、6、3操作步驟

霉菌酵母菌數(shù)測定一般與細菌數(shù)測定同時進行，按規(guī)定取兩

個以上包裝的供試品，并視供試品的污染程度制備1：10、1：

100,1：1000三級稀釋度的供試液。分別注入平皿，每個稀釋

級做2?3個平板。另取一支1ml吸管吸取稀釋劑各1ml注入2

個平皿中，作為陰性對照，每皿加約15ml已熔化并保溫45℃的

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，加畢立即搖勻，待凝固后倒置于23?28℃

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要

時，可適當延長培養(yǎng)時間至7天進行菌落計數(shù)報告。

3、6、4計數(shù)

一般情況下，玫瑰紅鈉平板點計霉菌或酵母菌數(shù)，如在該平

板上生長的細菌菌數(shù)多于營養(yǎng)瓊脂平板上生長的菌數(shù)時，則應(yīng)同

時點計細菌數(shù)，并將該菌數(shù)作為供試品的細菌數(shù)報告。

3、6、5菌落報告的規(guī)則

選擇平均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取

兩位有效數(shù)字）的依據(jù)，以最高平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告

lg、1ml或10cm?供試品中所含菌數(shù)。其報告規(guī)則同細菌數(shù)報告

規(guī)則。

3、6、6不得按計數(shù)規(guī)則報告的情況。

3、6、6、1陰性對照平板有菌生長，表明培養(yǎng)基已被污染。

3、6、6、2各稀釋級平板上生長的菌落數(shù)不符合10倍遞增

稀釋規(guī)律，菌數(shù)顯示混亂。

3、6、6、3同一稀釋級的兩個平板上生長的菌落數(shù)均在15

個以上，但菌數(shù)相差一倍以上。

3、6、6、4菌落蔓延生長覆蓋整個平板無法計算數(shù)。

出現(xiàn)以上情況，該次實驗數(shù)據(jù)不得計數(shù)報告。

3、6、7結(jié)果報告

結(jié)果報告與“3、5、3條”相同。

3、6、8復(fù)試

供試品檢測，霉菌或酵母菌數(shù)不合格的，應(yīng)重新倍量取量，

平行復(fù)試兩次，取三次測定數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值報告。如初試時

霉菌或酵母菌數(shù)已超過標準規(guī)定3倍以上可不予復(fù)試，直接取初

試數(shù)據(jù)報告。

3、6、9注意事項

3、6、9、1細菌與酵母菌落的區(qū)別。

細菌和酵母菌都是單細胞的微生物，有的嗜酸性細菌可在玫

瑰紅鈉平板上生長，由于兩者菌落形態(tài)具有類似的特征，如較濕

潤、光滑、易挑起，菌落正、反面及邊緣、中心的顏色較一致，

質(zhì)地均勻等。但酵母菌菌落單個者一般較大，生長在瓊脂表面者

凸起較高、無光澤，呈邊緣整齊的正圓形，乳酪狀，菌落表面培

養(yǎng)物極易被挑起。生長在瓊脂內(nèi)的菌落有的呈鐵餅形、三角形。

酵母產(chǎn)生的色素較單一，通常為白或奶油色。少數(shù)為紅色或黑色。

產(chǎn)生假菌絲的種類，細胞易向外圍蔓延，邊緣粗糙不齊。直觀不

能判別的可供助顯微鏡檢，根據(jù)細胞大小、細胞群體中的出芽生

殖情況及形成假菌絲的形態(tài)，便可以加以識別。

3、6、9、2注意酵母菌形成的假菌絲與霉菌絲的區(qū)別：

酵母菌的假菌絲實際是酵母菌在行無性繁殖時產(chǎn)生的特性

形態(tài)，即芽硝子到正常大小時不與母細胞分離而再繼續(xù)出芽生殖

所形成的。假菌絲中子細胞與母細胞之間僅以極狹窄面積相連，

兩細胞之間呈現(xiàn)藕節(jié)一樣的細胞，而霉菌有隔菌絲的橫隔處兩細

胞寬度是一致的。

3、6、9、3霉菌菌落計數(shù)時，平板不宜反復(fù)翻動，以防止

霉菌弦子在翻動時散落并長成新的菌落而影響計數(shù)。

3、7大腸埃希菌檢查法

大腸埃希菌檢查法采用MUG—Indole大腸埃希氏桿菌檢查

法，即將MUG與Indole試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔

以IMVic試驗。

3、7、1儀器、設(shè)備及用具：

儀器、設(shè)備及用具同“3、5、1、1條”。

3、7、2試液、指示液

0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉一蛋白月東緩沖液、

pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液，靛基質(zhì)（Indole）試液、甲基紅指示液;

a一蔡酚乙醇試液；40%氫氧化鉀溶液、甲紫染液、革蘭碘液、

95%乙醇、番紅復(fù)染液。

3、7、3培養(yǎng)基：

膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、

4一甲基傘形酮葡萄糖甘酸培養(yǎng)基（MUG）、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)

基（EMB）或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）、蛋白陳水培養(yǎng)基、磷

酸鹽葡萄糖月東水培養(yǎng)基、枸椽酸鹽培養(yǎng)基。

3、4、4對照用菌液

取大腸埃希氏桿菌［CMCC（B）44102］的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的新

鮮培養(yǎng)物少許（1白金耳）、接種至9ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于30-35

°C培養(yǎng)18-24小時后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1：1（A

使對照菌液加入量含菌50?100個（一般為0.1ml）,同時用營養(yǎng)

瓊脂平板計數(shù)（以確定菌液濃度個/ml）o

3、7、5檢驗程序圖解

.

革蘭

枸椽

靛

基

染

氏

鹽

酸

質(zhì)

試

鏡

色

驗

試

驗I

C檢

30-35℃24-48hrs

報告

3、7、6操作方法

3、7、6、1供試液的制備:見“3、4條”。

3、7、6、2增菌培養(yǎng)：

取膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）3瓶，每瓶各100ml。2瓶分別加入

供試液10ml,其中一瓶加入對照菌50?100個作為陽性對照。第

3瓶加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。36±1℃培養(yǎng)18-

24小時（必要時可延長至48hrs）。陰性對照應(yīng)無菌生長。

3、7、6、3MUG葡萄糖醛酸甘酶試驗。

搖勻上述BL增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增

菌培養(yǎng)液、供試品陽性對照培養(yǎng)液，陰性